增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建

构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3．1( )-EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记．     

pCMV-tag2A/NAP1融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

从含有目的基因的cDNA克隆中,利用PCR方法钓取目的基因.将目的基因与酶切线性化的载体进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞.采用菌落PCR方法和核酸序列测定进行阳性克隆鉴定.对构建好的pCMV-tag2A/NAP1融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提.     

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.     

分泌型Survivin真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建含6个组氨酸标签(His6)的小鼠存活素(Survivin)融合蛋白的真核表达载体,及其在真核细胞中的表达。方法:根据小鼠Survivin序列设计引物,经过RT-PCR克隆Survivin的cDNA并进一步构建分泌型Sur-vivin的真核表达载体,经测序鉴定后在大肠杆菌中扩增在HeLa细胞中表达;以金属离子螯合层析富集,再用免疫印迹法鉴定。结果:克隆到Survivin编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同。构建氨基端融合小鼠IL-2信号肽,羧基端带有His6标签的Survivin融合蛋白的真核表达载体,在HeLa细胞中转染成功并且表达;细胞上清经HisTrap HP柱层析富集后,进行免疫印迹分析,表明该融合蛋白以分泌型方式在HeLa细胞中表达。结论:成功克隆Survivin的cDNA,并构建其分泌型真核表达载体。     

应用Petri网对CSMA/CD的描述及分析

Petri网已经被成功地用来描述、验证及评价网络通信协议。本文阐述了扩充Petri网在研究CSMA/CD协议方面的应用。扩充是在两个方面完成的,即加入了禁止弧和时间的概念。通过使用可达图(树)和时间可达图等分析技术,介绍了CSMA/CD的一些重要性质。     

pVT102U/α-bgln重组真核表达质粒的构建和鉴定

构建重组真核表达质粒pVT102U/α-bgln使之可以在酿酒酵母中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以含有从黑曲霉中获得的编码β-葡萄糖苷酶(bgln)成熟肽的cDNA的克隆质粒pMD19T-bgln为模板,用PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln),利用真核表达载体pVT102U/α构建pVT102U/α-bgln重组质粒,PCR结果显示扩增片段约2.6 kb,与预期相同.用酶切电泳验证重组结果的正确性,重组质粒酶切后显示其大小约10 kb,大小及酶切图谱与预期相同.测序检测质粒重组后序列情况,经测序发现插入片段两端序列无改变,且读码框正确.pVT102U/α-bgln质粒构建成功.     

RNA干扰技术抑制SGIV ICP18绿色荧光融合蛋白表达的研究

 将含有新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）ICP18基因的真核表达载体pEGFP-ICP18转染到胖头鲤细胞（Fathead minnow cells,FHM）中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP18 GFP融合蛋白呈点状分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIV ICP18的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIV ICP18的siRNA（siRNA ICP18）,与pEGFP ICP18共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点的荧光强度变化。与序列非特异性siRNA（siRNA negative）阴性对照相比,转染后24~48 h,共转染siRNA ICP18和pEGFP ICP18的实验细胞中发荧光的细胞数量较阴性对照少60%~80%左右,说明体外化学合成的siRNA-ICP18可有效抑制FHM细胞中外源导入SGIV ICP18基因的表达。     

c-Src结构域真核表达载体的构建及鉴定

通过聚合酶链式反应(PCR),将c-Src的三个结构域SH3、SH2和KD分别定向克隆至C端带有HA蛋白标签序列的真核表达载体pcDNA3中.经HindIII和XbaI双酶切分析和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞48 h,蛋白免疫印迹法可以检测到细胞内SH3、SH2和KD的表达,证明重组表达质粒pcDNA3-SH2、pcDNA3-SH3和pcDNA3-KD构建成功,为进一步研究Src激酶在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

基于NS2的CSMA/CD协议的模拟及分析

NS2是目前学术界广泛使用的一种网络仿真软件,也常被用于计算机网络课程的教学中。在介绍NS2模拟网络运行的一般流程和一些常用的分析工具的基础上,描述了以太网MAC子层协议CSMA/CD的工作原理,实验模拟运行及对跟踪文件的分析说明了以太网的数据传送方式及性能影响因素,可以很好地用于计算机网络课程中以太网协议内容的教学。     

含CpG motifs的乙肝表面抗原载体的构建及表达

构建了编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-CpGS2S，其中通过PCR克隆了若干CpG motifs到质粒载体中。经酶切鉴定和测序正确后将重组质粒体外转染COS7细胞，ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性，说明重组质粒pVAX-CpGS2S在体外能够有效表达HBsAg，为探讨CpG motifs克隆入DNA疫苗载体后对体内免疫反应的影响打下基础。     

新型嵌合补体抑制分子HCI-3的设计构建及真核细胞表达的研究

目的：基于抑制补体活化的两个关键环节，即C3／C5转化酶及MAC的形成，设计、构建及制备一种新型、高效的补体抑制剂．方法：首先设计引物，通过PCR技术扩增重组可溶性CD46／CD55／CD59嵌合分子cDNA片段，重组于pcDNA3．1( )真核表达载体上，构建兼有三分子功能的CD46／CD55／CD59嵌合补体抑制分子，命名为HCI-3(Human Chimeric Complement Inhibitor,HCI-3)．分别利用COS-7细胞和CHO细胞进行表达，并用抗人CDl6多抗及抗人CD55，CD59单抗对表达产物进行Western Blotting鉴定．结果：DNA测序结果证实，前端带有CD59信号肽序列，后端融合有编码6个组氨酸碱基的HCl-3 cDNA片段的阅读框完整．免疫印迹结果显示，表达的重组蛋白分别能与抗人CD46多克隆抗体和抗人CD55，CD59单抗结合．结论：成功构建并在真核细胞内表达了重组可溶性HCl-3分子，为进一步研制和开发新一代多功能、多靶点补体抑制剂奠定了基础．