酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子elF3e(eukaryotic trans-lation initiation factor 3,subunit E interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子elF3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.     

含外显子8的prosaposin蛋白亚型与Rhox5蛋白间的相互作用

研究含外显子8的prosaposin蛋白亚型(PsapE8)与同源异型框蛋白Rhox5蛋白间的相互作用. 重叠延伸PCR法扩增PsapE8的cDNA序列,将其按照通读框方式分别克隆至pGBKT7和pGADT7酵母双杂交载体中构建pGBKT7-PsapE8和 pGADT7-PsapE8重组质粒. 酵母双杂交实验检测PsapE8与Rhox5蛋白在酵母体内的结合;体外转录翻译S35标记的PsapE8蛋白,GST pull-down实验检测PsapE8与Rhox5蛋白在体外的结合情况. 成功地构建了pGBKT7-PsapE8和 pGADT7-PsapE8重组质粒,酵母双杂交实验表明PsapE8蛋白在酵母体内可以结合Rhox5蛋白;GST pull-down实验再次验证了两者在体外的结合;表明含有外显子8的prosaposin蛋白亚型PsapE8可以与Rhox5蛋白相结合.     

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.     

酵母双杂交筛选血液中与PERIOD1相互作用的新蛋白

采用酵母双杂交方法,以人PER1的PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选能与之相互作用的蛋白.经酶切和核苷酸序列测定,证实重组诱饵载体hper1PAS/pGBKT7构建成功.血cDNA文库转化效率为1.4×106/3μg pGADT7-Rec.酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat Protein CP)和移动蛋白(Movement Protein MP)基因序列合成了CP，MP基因的上下游引物，通过PCR扩增获得目的片段，经过Sal I和Rst I酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒相互作用的寄主因子、克隆寄主因子，推测其种类和功能打下基础。     

视网膜母细胞瘤结合蛋白4基因酵母双杂交诱饵载体的构建

视网膜母细胞瘤结合蛋白4(RBBP4)是WD-40蛋白家族的成员之一,其在组蛋白乙酰化、细胞周期进展及肿瘤干细胞的分化等方面具有重要功能,研究与RBBP4互作的新蛋白质和认识RBBP4在疾病包括肿瘤的发生发展过程中的分子机制有重要意义。通过RT-PCR扩增获得了RBBP4基因的CDS序列,经双酶切后与pGBKT7酵母诱饵载体连接构建了pGBKT7-RBBP4载体,再通过双酶切鉴定和测序验证,结果表明此酵母双杂交诱饵载体被成功构建,为后续利用酵母双杂交技术筛选与RBBP4蛋白相互作用的新蛋白提供了参考。     

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF50结合蛋白的筛选

应用酵母双杂交系统,以包含RTA氮端530个氨基酸的片段插入载体pGBKT7作为诱铒,在人脾脏cDNA文库中,筛选得到4个阳性AD/文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD/文库质粒与RTA的相互作用.将阳性AD/文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是:TLE2、RBP-Jk、ZNF-12和WHSC1.     

NT3的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。     

筛选hALR的相互作用蛋白基因(英)

为筛选与人肝再生增强因子(hALR)相互作用蛋白的基因,探讨肝再生增强因子在肝再生过程中的分子生物学机制,将人肝再生增强因子基因的开放读码框片断,重组入载体pGBKT7构建成“诱饵”质粒pGBKT7-hALR,然后用酵母双杂交系统从预转化酵母菌Y187的成人肝细胞cDNA文库中筛选与人肝再生增强因子相互作用蛋白的基因.筛出的阳性克隆基因序列被测出后,经GenBank查询,结果发现它们分别是血清白蛋白、金属硫蛋白、硒蛋白类似物、Na+/K+ ATPase和一个未知功能的蛋白的部分序列.这初步克隆了与hALR相互作用的蛋白基因,为进一步探讨ALR在肝再生过程中的作用机制奠定了基础.     

筛选hALR的相互作用蛋白基因

为筛选与人肝再生增强因子(hALR)相互作用蛋白的基因，探讨肝再生增强因子在肝再生过程中的分子生物学机制，将人肝再生增强因子基因的开放读码框片断，重组入载体pGBKT7构建成“诱饵”质粒pGBKT7—hALR，然后用酵母双杂交系统从预转化酵母菌Y187的成人肝细胞cDNA文库中筛选与人肝再生增强因子相互作用蛋白的基因。筛出的阳性克隆基因序列被测出后，经GenBank查询，结果发现它们分别是血清白蛋白、金属硫蛋白、硒蛋白类似物、Na^ ／K^ ATPase和一个未知功能的蛋白的部分序列。这初步克隆了与hALR相互作用的蛋白基因，为进一步探讨ALR在肝再生过程中的作用机制奠定了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质

用NAP1作为"诱饵"蛋白,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,鉴定阳性克隆;再利用酵母双杂交和免疫共沉淀验证相互作用. 结果表明,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,阳性克隆的鉴定,发现了与NAP1的相互作用蛋白质―蛋白酶体α亚基3(PSMA3). 免疫共沉淀(Co-IP)结果证实外源表达的NAP1蛋白和PSMA3蛋白在293T细胞中有特异性的相互作用. NAP1作为FDC分泌的一种多肽,与PSMA3有特异性的相互作用,这种相互作用如何实现对蛋白酶体降解靶蛋白的活性调节,其作用机理有待深入研究.     

用酵母双杂交检测BAR与PDZ结构域的相互作用

用酵母双杂交系统探索P ICK 1分子中BAR结构域与PDZ结构域的相互作用.分别构建了pGAD-PDZ和pGBK-BAR重组子,共转入酵母细胞后,涂布于SD(L eu-,T rp-,H is-)固体平板培养基,经滤纸复印和显色反应,在8 h内观察到只有pGAD-PDZ/pGBK-BAR的表达产物呈阳性,而其它对照pGADT 7/pGBKT 7、pGAD-PDZ/pGBKT 7和pGADT 7/pGBK-BAR均呈阴性反应,说明BAR与PDZ结构域具有相互作用.     

专题报道Ⅰ：松材线虫病致病机理与病害防治（执行主编 叶建仁）专题编者按

松材线虫病是在我国发生最严重的毁灭性森林病害,已经在10多个省市区造成了严重的经济和生态损失。该病害原产地为北美洲,自20世纪初先后传入东亚的日本、中国和韩国等,给这些国家的松林带来了巨大的破坏。我国于1982年首次在南京发现松材线虫病,40年来病害一直在不断扩展蔓延。至2021年底,我国有19个省（自治区、直辖市）的728个县级行政区被划分为疫区,当年病死松树达到数千万株,防控形势异常严峻。本专题针对当前松材线虫病流行与防控中的一些热点和难点问题,围绕分子致病机理、疫源追溯和病害防治方法等方面开展研究,通过RNA干扰、基因重组和酵母转化实验明确松材线虫性别分化基因和热激转录因子在生长发育过程中和性别分化中具有的重要作用;以新一代测序技术、分子标记手段研究分析松材线虫在我国的种群分化情况,揭示不同线虫类群与地理区域间呈现的相关性;利用微生物培养、浸渍提取法和生理生化指标测定等方法,筛选并获得一系列对松材线虫具有明显拮抗作用的腐生线虫、松树内生细菌和植物提取物。本专题研究内容有助于深入解析松材线虫病在我国的传播蔓延规律,揭示松材线虫致病关键基因功能,提出病害防控的新方法,从而为更好地防控这一重大外来入侵物种引起的病害提供重要的理论和实践支撑。     

Interaction of Stathmin-Like 2 Protein with the APP Intracellular Domain

Amyloid precursor protein （APP） plays a critical role in the formation of Alzheimer＇s disease （AD）. The intracellular domain APP （AID） was suggested to cause neurotoxicity in the nucleus. To investigate the functions AID, yeast two-hybrid screening was performed to identify the proteins which interact with AID. The human brain cDNA library was screened using pGBKT7-AID as a bait, and several positive clones were identified. One of them encodes a part of the human stathmin-like 2 protein （STMN2）. The interaction between STMN2 and APP implies that STMN2 may have an important function in APP-mediated AD formation.     

小鼠H-2D~b-BSP融合基因的构建与表达

目的:构建小鼠H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌中表达.方法:采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠淋巴细胞中扩增出H-2Db链的胞外段基因,经双酶切置换已构建的HLA-A*0201-BSP重组体中的HLA-A*0201胞外段序列,使H-2Db与BirA酶底物肽(BSP)序列融合,构建H-2Db-BSP融合基因表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导融合蛋白表达.结果:构建的H-2Db-BSP融合基因插入正确且序列与GenBank一致;经1mmol/L浓度的IPTG诱导后4h蛋白表达达到高峰,且融合蛋白以包涵体形式存在.结论:成功构建H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步构建H-2Db四聚体,研究T细胞应答提供了物质基础.     

小麦SBEⅡb基因的克隆及其与PDS基因串联VIGS载体的构建

为探讨以PDS基因为指示基因利用VIGS技术研究小麦SBEⅡb基因的功能,本研究拟构建小麦SBEⅡb和PDS的双基因串联VIGS重组载体。根据GeneBank中公布的小麦SBEⅡb(AY740401.1)和PDS(FJ517553.1)基因序列分别设计搭桥引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡb和PDS基因的特异片段,利用SOE-PCR技术获得双基因融合片段SBEⅡb:PDS。然后以BSMV:γ-PDS为原载体,通过酶切连接,用SBEⅡb:PDS基因片段将原载体中的PDS基因片段进行替换,从而构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。结果显示克隆的SBEⅡb和PDS基因片段长分别是181和190 bp,SBEⅡb:PDS片段长是370 bp。序列分析表明:SBEⅡb基因片段与小麦SBEⅡb(AY740401.1)序列同源性为97%;小麦PDS基因片段与PDS(AF155217.2)序列同源性也为97%;酶切鉴定结果表明成功构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。本研究构建的BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体将在PDS基因的指示下为下一步利用VIGS技术在小麦上研究SBEⅡb基因与小麦淀粉合成的关系奠定了基础。     

白细胞介素24在抗肿瘤方面的应用

人类黑色素瘤分化相关基因-7/白介素-24(MDA-7/IL-24)是近年发现的具有细胞因子特性的抗肿瘤作用的基因,它能够通过膜受体或非受体介导的凋亡途径对多种肿瘤细胞产生杀伤作用,而对正常细胞没有影响.此外,IL-24还具有抑制肿瘤新生血管形成、增强放疗敏感性和免疫调节作用.作为一种具有多种抗肿瘤功能的细胞因子IL-...