重组GATA4腺病毒的构建及心肌细胞感染

利用AdEasy腺病毒表达系统构建了GATA4基因过表达腺病毒.编码大鼠GATA4基因的目的片段克隆入pAdTrackcmv质粒,pAdTtrackcmv-GATA4穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转入含pAdEasy-1的BJ5183菌进行同源重组.pAdEsay-GATA4重组质粒经卡那霉素抗性筛选及PacⅠ酶切鉴定.pAdEsay-GATA4转入293A细胞进行包装,产生具有感染性的重组病毒.Ad-GATA4重组病毒感染HeLa及乳鼠心肌细胞,通过免疫印迹及实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测GATA4表达及促心肌肥大效应.Ad-GATA4重组病毒感染乳鼠心肌细胞后,诱导心肌细胞表面积明显增加,ANF表达明显增强.结果表明,Ad-GATA4腺病毒成功感染心肌细胞并诱导了大鼠心肌肥大表型的出现.     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

重组腺病毒介导RNA干扰人DLK1基因表达的研究

构建抑制人DLK1基因表达的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术评价其在肝癌细胞株中的基因沉默效应.将针对人DLK1基因的RNAi寡核苷酸序列,连接到腺病毒穿梭质粒中,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183内进行同源重组.重组腺病毒载体在HEK-293细胞中包装扩增,得到高滴度的重组腺病毒.通过绿色荧光蛋白示踪腺病毒的感染效果,并通过荧光实时RT-PCR,western blot的方法证实重组腺病毒能够显著抑制DLK1基因在肝癌细胞株中的表达.     

腺病毒介导ERK-2基因在生长板软骨细胞中的表达

目的:构建ERK-2基因重组腺病毒载体,检测构建的腺病毒感染原代大鼠生长板软骨细胞的效率以及目的基因的表达。方法:将ERK-2 cDNA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转染E.Col.i B J5183,将筛选、鉴定的重组腺病毒质粒线性化后转染HEK293细胞进行病毒颗粒的包装;流式细胞术检测不同感染复数(MO I)ERK-2重组腺病毒感染原代培养的大鼠肋生长板软骨细胞的效率,W estern b lot检测腺病毒感染的生长板软骨细胞中ERK-2蛋白的表达。结果:成功构建ERK-2重组腺病毒,MO I 50的腺病毒感染原代生长板软骨细胞的效率大于90%,感染的生长板软骨细胞中ERK-2表达显著增加。结论:构建的重组腺病毒可介导ERK-2基因在原代大鼠生长板软骨细胞中高表达。     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.     

靶向hTERT的shRNA腺病毒载体的构建及其对MCF-7细胞hTERT表达的影响

设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT,构建siRNA表达质粒PgenesilhTERT;随后将shRNA表达框克隆到入门载体pENTRTM1A,构建重组质粒pENTR/U6-hTERT-polyA;使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体pAd/PL-DEST,得到重组腺病毒质粒pAd/U6 –TERT-polyA;线性化的重组腺病毒质粒在HEK 293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒rAd-hTERT.同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照rAd-HK,空病毒对照rAd-blank和只含EGFP的rAd -EGFP.四种病毒经酶切、电泳分析表明插入序列正确,腺病毒载体构建成功.Western blotting测定转染后各组hTERT蛋白的表达情况,证实转染rAd-hTERT 48 h后,hTERT的表达明显被抑制.实验表明基于Gateway技术的腺病毒介导的shRNA载体构建成功,rAd-hTERT可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT基因的表达.本研究为针对端粒酶的基因治疗奠定了实验基础.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

目的:运用pADxsi系统构建带人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体.方法:采用基因克隆技术,将目的基因NGN3从pEGFP-N1-NGN3质粒上切下连到pShuttle-GFP-CMV上,替换GFP,得到pShuttle-CMV-NGN3;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上切下连到系统pShuttle-CMV-NGN3上,得到pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4穿梭质粒;最后将CMV-NGN3/CMV-PAX4从pShuttle-CMV-NGN3/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架载体上,得到pADxsi-CMV-NGN3/CMV-PAX4病毒质粒,然后在293细胞中进行包装与扩增活性病毒,并进行病毒滴度测定.体外感染人脐带间充质干细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)与免疫印迹(Western blotting)检测目的基因在细胞内的表达情况, 免疫细胞化学与间接荧光法检测目的分子在细胞内的定位.结果:酶切鉴定和PCR证明重组人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;RT-PCR与Western blotting结果显示目的基因在细胞持续稳定表达;间接荧光与免疫化学表明重组腺病毒可高效感染人脐带间充质干细胞,且目的基因特异性地定位于细胞核内.结论:应用重组技术成功构建人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体,且在间充质干细胞内持续而稳定表达.     

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.