莱茵衣藻外源基因整合特征分析及蛋白表达

将衣藻表达载体pSP108转化莱茵衣藻细胞壁缺陷型藻株CC-400,通过接头PCR获得并分析阳性转化子中ble基因的侧翼序列发现:外源基因的插入位点呈现随机性,并且有些转化子中衣藻基因组和质粒序列发生断裂和重排.通过间接ELISA分析外源蛋白表达量,并结合外源基因整合状态时发现:在ble基因启动子核心区域缺失的阳性转化子中,ble可以利用自身基因启动子进行蛋白表达,但表达量相比使用质粒载体PSP108上RBCS2启动子的表达量要低;在部分启动子完整的阳性转化子中蛋白表达量低下,可能与衣藻基因组大片段的缺失相关.     

莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白IFT81调控鞭毛组装

利用插入突变的方式获得了一株衣藻不运动突变体ift81,该突变体表现出鞭毛缺失或者短鞭毛的性状。基因序列分析表明,外源基因aphⅧ插入了突变体中IFT81( intraflagellar transport, IFT)基因的第五个外显子内,并导致该外显子原有的52个碱基对被替换。把含有完整IFT81基因的重组质粒导入突变体ift81后,其鞭毛恢复为野生型且可以检测到IFT81-HA融合蛋白的表达,这证明突变体的鞭毛缺陷确实是由于IFT81基因突变所导致。电镜观察显示突变体中鞭毛的显微结构发生改变,免疫荧光实验证实IFT81蛋白主要定位于基体和鞭毛部位。上述结果表明：IFT81蛋白缺失会导致衣藻鞭毛组装缺陷,在鞭毛组装所需蛋白的运输过程中,IFT81蛋白是必不可少的。     

莱茵衣藻生长和光合作用对硝基苯的响应

初步研究了不同浓度硝基苯对莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）生长和光合作用的影响．结果表明：不同浓度的硝基苯对莱茵衣藻的生长和光合生理有明显抑制作用，主要表现在其明显降低光合色素的含量、光能转换效率（Fv／Fm）、电子传递速率（ETR）、净光合速率（Pn）等方面；硝基苯对莱茵衣藻的影响主要是通过影响光合色素合成，降低光合作用电子传递，从而降低藻类的光合作用，引起生长的抑制．     

莱茵衣藻BBS1蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

Bardet-Biedlsyndrome-1(BBS1)是一种与纤毛信号传导相关的蛋白,关于其如何在信号传导中发挥作用以及作用机理目前尚不清楚.莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,因此制备莱茵衣藻BBS1蛋白多克隆抗体对阐明其作用机理意义重大.采用RT-PCR技术从C.reinhardtiiCC-125中提取总RNA,扩增1 731 bp的目的基因bbs1,插入到pET-28a(+)原核表达载体,成功构建pET-28a(+)-bbs1重组质粒,转入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-BBS1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶102 400,经免疫印迹实验(Westernblot)对C. reinhardtii CC-125检测具有较高特异性.实现了莱茵衣藻BBS1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻BBS1蛋白的多克隆抗体,为研究BBS1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号传导中的相互作用奠定了基础.     

莱茵衣藻玻璃珠法快速转化检测体系的建立

为了建立在衣藻中快速简便研究外源基因功能的方法,采用玻璃珠转化法将pBI221质粒（35S,Amp,GUS）高效转化至细胞壁缺陷型衣藻品系CW-15（Arg-）,通过对转化条件及GUS表达检测条件摸索,发现35S启动子在CW-15中能有效启动GUS表达,且GUS最佳检测时间约为转化后24h,重组细胞先染色后制片更有利于GUS检测.     

葡萄糖对莱茵衣藻生长和产氢的影响

通过在莱茵衣藻的培养基中添加葡萄糖,考察了葡萄糖对莱茵衣藻生长及产氢的影响。结果表明,在Tris Acetate Phosphate (TAP)培养基中添加葡萄糖对莱茵衣藻生长有利,最佳葡萄糖浓度为03g/L,藻细胞数和叶绿素浓度分别提高了12.8％和16.4％。在产氢培养基中,添加葡萄糖对莱茵衣藻产氢也有促进作用,氢气产量提高了27％。     

莱茵衣藻叶绿体PsbA启动子的克隆及其活性验证

为验证莱茵衣藻叶绿体基因PsbA启动子活性,提取了莱茵衣藻总DNA。设计基因PsbA启动子引物,以总DNA为模板,利用PCR法扩增,然后与质粒P64D连接。将重组质粒转入大肠杆菌Dh5α。用氨苄青霉素和壮观霉素筛选,进行活性验证。结果成功地从莱茵衣藻基因组中克隆出PsbA启动子片段(1 161 bp),获得了氨苄青霉素和壮观霉素抗性菌落,表明该序列具有启动子活性。     

莱茵衣藻-se两步法产氢用培养基的研究

分析了TAP（Tris—Acet．Phosphate）、seTA（se—Tris—Acet）、seP（se—Phosphate）、seTH（se．Tris-HCl）和se5种培养基对莱茵衣藻-se生长产氢的影响，并进行了培养基的含量分析．结果发现，培养基的pH和氮素的含量是影响莱茵衣藻生长的重要因素；而培养基中醋酸根的含量则有助于提高厌氧产氢过程中衣藻的氢酶活性，从而提高其产氢量．综合考虑两步法产氢对细胞生长周期和细胞密度的要求以及最终厌氧诱导获得的氢酶活性，最终选择seTA培养基作为莱茵衣藻-se产氢用培养基．     

莱茵衣藻-se两步法产氢用培养基的研究

分析了TAP(Tris-Acet-Phosphate)、seTA(se-Tris-Acet)、seP(se-Phosphate)、seTH(se-Tris-HCl)和se这5种培养基对莱茵衣藻-se生长产氢的影响,并进行了培养基的含量分析.结果发现,培养基的pH和氮素的含量是影响莱茵衣藻生长的重要因素;而培养基中醋酸根的含量则有助于提高厌氧产氢过程中衣藻的氢酶活性,从而提高其产氢量.综合考虑两步法产氢对细胞生长周期和细胞密度的要求以及最终厌氧诱导获得的氢酶活性,最终选择seTA培养基作为莱茵衣藻-se产氢用培养基.     

莱茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

IFT139是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)纤毛内运输蛋白IFT复合物A中的一个重要组分.其编码基因的突变、缺失或沉默将会影响纤毛正常的组装和解聚,进而导致纤毛病的产生.为深入研究IFT139的作用机制,本实验首先PCR获得ift139 5′端458 bp的EST片断,成功构建了p MAL-c2-ift139与p ET-28a(+)-ift139重组质粒.然后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,分别得到相对分子质量为6.0×104和2.5×104的重组MBP/HIS-IFT139融合蛋白.进一步将亲和纯化的MBP-IFT139融合蛋白(纯度95%,以上),免疫新西兰大白兔获得抗血清,间接ELISA法测得血清效价为1﹕256,000.最后将抗血清依次经Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blot检测抗体特异性,结果显示所制备抗体能够正确特异性识别莱茵衣藻中的IFT139,从而为IFT139作用机制的阐明和纤毛相关疾病的研究奠定了重要基础.     

几种植物对铜绿微囊藻和莱茵衣藻的影响

通过添加植物浸提液,研究了13种陆生植物枫杨、核桃、核桃楸、毛白杨、垂柳、构树、无花果、侧柏、云杉、雪松、白蜡树、金叶女贞和紫丁香对两种富营养化藻类铜绿微囊藻和莱茵衣藻的抑制作用.结果表明,枫杨、核桃、核桃楸、构树与雪松对两种藻类均具有显著的抑制作用;毛白杨、垂柳只对铜绿微囊藻具有抑制作用;而金叶女贞、紫丁香只对莱茵衣藻具有抑制作用.在浸提液对水体浊度的影响实验中,雪松、云杉和白蜡树浸提液都可以有效降低水体浊度.雪松、枫杨、核桃楸、核桃4种植物是具有应用前景的陆生抑藻植物材料.     

莱茵衣藻腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的相互作用蛋白组分析

微藻利用光能和CO₂合成淀粉作为藻细胞的储能物质,是以燃料乙醇为代表的液体生物燃料的可持续原料来源.理解微藻淀粉代谢关键酶的催化机制和调控方式是基因工程操作以提高藻细胞淀粉积累能力的前提. 基于此,以莱茵衣藻淀粉合成代谢中的关键酶腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化亚基为探针蛋白,获取该酶的GST融合蛋白后使用GST沉降分析实验结合HPLC-MS/MS的蛋白质检测技术及生物信息学分析方法获得一组与AGPase催化亚基存在相互作用蛋白质,主要包含分子伴侣蛋白、光合作用相关蛋白和信号蛋白分子等. 通过综合分析上述蛋白组的生理功能及亚细胞定位,揭示了它们通过与AGPase相互作用在淀粉合成代谢中的生物学意义.      

Co2+对莱茵衣藻生长及类囊体膜功能的影响

本文用不同浓度的CoCl2处理莱茵衣藻,结果表明：当钴离子浓度大于0.05 mmol/L时,莱茵衣藻的生物量和叶绿素含量显著下降.然后用不同浓度的CoCl2处理莱茵衣藻的类囊体膜,分析了Co2+处理前后类囊体膜的室温荧光发射光谱、DCIP光还原活性以及多肽组分的变化.结果显示：Co2+处理（0.5~4 mmol/L）改变了Chla,Chlb以及蛋白质氨基酸残基的微环境,影响了类囊体膜PSⅡ的供体侧和反应中心,导致类囊体膜上PSⅡ的电子传递被阻断.     

重组人朊蛋白成纤维研究进展

基于目前重组人朊蛋白体外成纤维实验研究,本文简单总结了重组人朊蛋白纤维的特点,以及利于重组蛋白纤维化的条件和方法,包括酸性pH、低浓度变性剂和高速振荡,旨在推动建立体外重组人朊蛋白成纤维模型,为揭示朊病毒致病机制提供依据。     

甘蔗基蔗糖高附加值利用的研究进展

蔗糖占我国食糖总消费量90%以上,而甘蔗是蔗糖的主要原材料。然而,我国甘蔗生产集约化程度低,导致制糖成本越来越高,提高甘蔗及副产品的资源化利用水平,对我国甘蔗制糖产业具有重要意义。本文综述近年来甘蔗基蔗糖高附加值生物转化利用方面的研究进展,总结蔗糖生物催化相关的关键酶元件,以及多酶级联催化技术转化蔗糖制备结构多样性功能产品方面的应用,阐述微生物发酵技术利用蔗糖及糖蜜制备大宗化学品和精细化学品方面的潜力,进一步探讨甘蔗基蔗糖高附加值利用的研究方向。     

基因工程重组过敏性蛋白(变应原)研究进展

目前,全球大约有25%的人口受到I型变态反应疾病的影响,而对此惟一有效的办法是应用特异性变应原进行免疫治疗(脱敏治疗).在应用天然变应原提取物进行传统免疫治疗的过程中,由于天然提取物应用时的计量很难标准化,因而影响了治疗的效果.而通过基因工程的方法所合成的修饰后高纯度特异变应原在保持过敏性蛋白完整的免疫活性的同时可降低其本身的过敏性,这种修饰后的过敏性蛋白的应用将使免疫治疗更趋于标准化,操作更加安全,最终可达到提高免疫治疗效果的目的.目前,重组修饰过敏性蛋白已经成为过敏性疾病研究的新热点.     

抗细胞凋亡蛋白DAD研究进展

结合国内外的研究,从抗细胞凋亡基因DAD(defender against cell death)的发现、核苷酸序列同源性、表达特性和蛋白结构与功能等方面,对近年来DAD蛋白的研究进展进行了综述.DAD作为寡聚糖转移酶(oligosaccharyltransferase,OST)的亚基组分,参与了内质网(endoplasmic reticulum,ER)中蛋白质的N-糖基化修饰,抑制程序性细胞死亡,与动植物的生长发育及多种生理与病理过程密切相关.     

植物细胞钙靶蛋白的研究进展

简述了植物细胞的钙离子调控过程，对钙调蛋白、钙调磷酸酶B类蛋白和钙离子依赖型蛋白质激酶3类钙靶蛋白的最新研究进展进行了综述。     

重组VE-cad-Fc融合蛋白仿生构建细胞外基质

利用基因重组技术设计和构建了一种仿生的双功能仿生细胞外基质蛋白.其基本策略是将人血管内皮钙粘素胞外区(VE-cad)和免疫球蛋白(IgG1)Fc段进行基因融合构建真核表达载体,并利用FreeStyle293真核蛋白表达系统制备融合蛋白VE-cad-Fc,利用Western blot鉴定融合蛋白,并观察了该VE-cad-Fc融合蛋白基质对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)粘附和形态的影响.结果显示,成功克隆了VE-cad胞外段基因,并与Fc段重组形成VE-cad-Fc融合基因.在转染24h后,利用兔抗人VE钙粘素胞外区抗体验明该融合蛋白的免疫抗原性,其分子质量约为90.3KD,进一步的结果证明VE-cad-Fc融合蛋白是以二聚体的形式存在.优化该制备体系最佳表达时间为72h.细胞试验表明,VE-cad-Fc融合蛋白可显著促进HUVECs的粘附和生长.这种工程化的多功能融合蛋白基质在组织工程、再生医学和分子生物学领域有广阔的应用前景.     

工程益生菌用于疾病诊断治疗和细胞工厂的研究进展

随着科学技术的发展,益生菌因其独特的生理功能逐渐影响人们的日常生活,其用途已被大众熟知并且接受,而利用合成生物学对益生菌进行改造后得到的工程益生菌也已逐渐成为相关领域的研究热点。作为下一代活性治疗药物,经过改造后得到的工程益生菌可针对特定疾病发挥其独特作用,例如,在肠道菌群微环境、代谢性疾病的监测以及肿瘤靶向治疗等方面已广泛应用。此外,随着益生菌在食品工业中的出色作用和益生菌的功能,其微生物代谢特性也越来越受到人们的关注,工程益生菌在代谢过程中不仅能产生有机酸、胺类、维生素等多种产物,还能改善发酵食品口味,增加产品营养,在食品工业中广泛应用。重点介绍了对经过改造后的工程益生菌的作用及其应用前景。