莱茵衣藻叶绿体PsbA启动子的克隆及其活性验证

为验证莱茵衣藻叶绿体基因PsbA启动子活性,提取了莱茵衣藻总DNA。设计基因PsbA启动子引物,以总DNA为模板,利用PCR法扩增,然后与质粒P64D连接。将重组质粒转入大肠杆菌Dh5α。用氨苄青霉素和壮观霉素筛选,进行活性验证。结果成功地从莱茵衣藻基因组中克隆出PsbA启动子片段(1 161 bp),获得了氨苄青霉素和壮观霉素抗性菌落,表明该序列具有启动子活性。     

莱茵衣藻BBS1蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

Bardet-Biedlsyndrome-1(BBS1)是一种与纤毛信号传导相关的蛋白,关于其如何在信号传导中发挥作用以及作用机理目前尚不清楚.莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,因此制备莱茵衣藻BBS1蛋白多克隆抗体对阐明其作用机理意义重大.采用RT-PCR技术从C.reinhardtiiCC-125中提取总RNA,扩增1 731 bp的目的基因bbs1,插入到pET-28a(+)原核表达载体,成功构建pET-28a(+)-bbs1重组质粒,转入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-BBS1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶102 400,经免疫印迹实验(Westernblot)对C. reinhardtii CC-125检测具有较高特异性.实现了莱茵衣藻BBS1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻BBS1蛋白的多克隆抗体,为研究BBS1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号传导中的相互作用奠定了基础.     

盐生杜氏藻和衣藻双结构域NAD+GPD基因的生物信息学分析

将盐生杜氏藻(Dunaliella salina)双结构域(SerB和GPD)3-磷酸甘油脱氢酶基因(NAD+-GPD)序列与莱茵衣藻全基因组进行比对,发现莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中也存在具有SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因序列.在对两个物种NAD+-GPD基因的基因结构、mRNA组成成分、编码蛋白及其理化性质和编码蛋白结构的分析中,发现二者具有较高的相似性.针对目前仅在盐藻和衣藻中发现含SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因这一现象,分别对SerB和GPD结构域同源基因的系统进化进行了分析.     

盐生杜氏藻和衣藻双结构域NAD+-GPD基因的生物信息学分析

盐生杜氏藻（Dunaliella salina）是极端耐盐的单细胞真核绿藻,依赖于NAD的3－磷酸甘油脱氢酶（NAD+-GPD）是盐生杜氏藻调渗物质——甘油合成的关键酶.盐生杜氏藻NAD+-GPD基因是第一个被发现含双结构域（SerB和GPD）的GPD基因.而双结构域可能是盐生杜氏藻具有极强耐盐性和快速合成甘油的关键.通过与莱茵衣藻基因组数据库比对,发现莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中也存在具有SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因序列.在对两个物种NAD+-GPD基因的基因结构、mRNA组成成分、编码蛋白及其理化性质和编码蛋白结构的分析中,发现二者具有较高的相似性.针对目前仅在盐藻和衣藻中发现含SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因这一现象,分别对SerB和GPD结构域同源基因的系统进化进行了分析.     

莱茵衣藻类胡萝卜素生物合成及其遗传控制的研究进展

随着对类胡萝卜素药用、食品、化妆等方面认识的提高,人类对类胡萝卜素的种类和产量需求也越来越高。单细胞真核微藻-莱茵衣藻是国际上研究光合作用遗传控制的最佳模式生物,也是天然类胡萝卜素主要来源之一。本文主要介绍了类胡萝卜素生物合成途径及用莱茵衣藻研究类胡萝卜素光合遗传控制等方面的最新研究进展。     

莱茵衣藻-se两步法产氢用培养基的研究

分析了TAP(Tris-Acet-Phosphate)、seTA(se-Tris-Acet)、seP(se-Phosphate)、seTH(se-Tris-HCl)和se这5种培养基对莱茵衣藻-se生长产氢的影响,并进行了培养基的含量分析.结果发现,培养基的pH和氮素的含量是影响莱茵衣藻生长的重要因素;而培养基中醋酸根的含量则有助于提高厌氧产氢过程中衣藻的氢酶活性,从而提高其产氢量.综合考虑两步法产氢对细胞生长周期和细胞密度的要求以及最终厌氧诱导获得的氢酶活性,最终选择seTA培养基作为莱茵衣藻-se产氢用培养基.     

莱茵衣藻外源基因整合特征分析及蛋白表达

将衣藻表达载体pSP108转化莱茵衣藻细胞壁缺陷型藻株CC-400,通过接头PCR获得并分析阳性转化子中ble基因的侧翼序列发现:外源基因的插入位点呈现随机性,并且有些转化子中衣藻基因组和质粒序列发生断裂和重排.通过间接ELISA分析外源蛋白表达量,并结合外源基因整合状态时发现:在ble基因启动子核心区域缺失的阳性转化子中,ble可以利用自身基因启动子进行蛋白表达,但表达量相比使用质粒载体PSP108上RBCS2启动子的表达量要低;在部分启动子完整的阳性转化子中蛋白表达量低下,可能与衣藻基因组大片段的缺失相关.     

斜纹夜蛾SlSCP-2真核表达载体的构建及对胆固醇的吸收

构建pcDNA5/FRT-SlSCP-2和阳性对照pcDNA5/FRT-GFP真核表达载体,将斜纹夜蛾固醇转运蛋白SlSCP-2和绿色荧光蛋白GFP分别整合进入Flp-In~(TM)CHO细胞基因组中的FRT位点上,利用western blotting方法和荧光倒置显微镜观察鉴定SlSCP-2和GFP蛋白在CHO细胞的表达情况.结果表明,重组质粒瞬时转染CHO细胞24h后,pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP均能正确表达目的蛋白,SlSCP-2能够增加细胞对胆固醇的吸收.同时确定了筛选稳定转染细胞株合适的潮霉素浓度.     

莱茵衣藻-se两步法产氢用培养基的研究

分析了TAP（Tris—Acet．Phosphate）、seTA（se—Tris—Acet）、seP（se—Phosphate）、seTH（se．Tris-HCl）和se5种培养基对莱茵衣藻-se生长产氢的影响，并进行了培养基的含量分析．结果发现，培养基的pH和氮素的含量是影响莱茵衣藻生长的重要因素；而培养基中醋酸根的含量则有助于提高厌氧产氢过程中衣藻的氢酶活性，从而提高其产氢量．综合考虑两步法产氢对细胞生长周期和细胞密度的要求以及最终厌氧诱导获得的氢酶活性，最终选择seTA培养基作为莱茵衣藻-se产氢用培养基．     

绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定

绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和p GEX-2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为2.6×10~4和5.2×10~4的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕32,000.抗血清依次经Protein A亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印迹实验(Western blot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.     

莱茵衣藻腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的相互作用蛋白组分析

微藻利用光能和CO₂合成淀粉作为藻细胞的储能物质,是以燃料乙醇为代表的液体生物燃料的可持续原料来源.理解微藻淀粉代谢关键酶的催化机制和调控方式是基因工程操作以提高藻细胞淀粉积累能力的前提. 基于此,以莱茵衣藻淀粉合成代谢中的关键酶腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化亚基为探针蛋白,获取该酶的GST融合蛋白后使用GST沉降分析实验结合HPLC-MS/MS的蛋白质检测技术及生物信息学分析方法获得一组与AGPase催化亚基存在相互作用蛋白质,主要包含分子伴侣蛋白、光合作用相关蛋白和信号蛋白分子等. 通过综合分析上述蛋白组的生理功能及亚细胞定位,揭示了它们通过与AGPase相互作用在淀粉合成代谢中的生物学意义.      

莱茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

IFT139是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)纤毛内运输蛋白IFT复合物A中的一个重要组分.其编码基因的突变、缺失或沉默将会影响纤毛正常的组装和解聚,进而导致纤毛病的产生.为深入研究IFT139的作用机制,本实验首先PCR获得ift139 5′端458 bp的EST片断,成功构建了p MAL-c2-ift139与p ET-28a(+)-ift139重组质粒.然后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,分别得到相对分子质量为6.0×104和2.5×104的重组MBP/HIS-IFT139融合蛋白.进一步将亲和纯化的MBP-IFT139融合蛋白(纯度95%,以上),免疫新西兰大白兔获得抗血清,间接ELISA法测得血清效价为1﹕256,000.最后将抗血清依次经Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blot检测抗体特异性,结果显示所制备抗体能够正确特异性识别莱茵衣藻中的IFT139,从而为IFT139作用机制的阐明和纤毛相关疾病的研究奠定了重要基础.     

衣藻的核基因组转化及外源基因转录分析

通过珠磨法将衣藻表达载体pSP108转入到莱茵衣藻细胞壁缺陷型CC-400藻株中,经抗性筛选及PCR鉴定,获得了24个转化藻株.在抗性基因ble编码序列的中间部位和末端部位分别设计两对不同的探针引物,运用实时荧光定量PCR对转基因藻株进行外源基因转录水平的分析.结果发现:不同转化藻株外源基因的转录水平有明显差异;同一转化藻株两对探针引物,外源基因的转录水平也存在差异.说明莱茵衣藻在转化过程中,外源基因整合到基因组上的片段数量及片段长度和完整性具有不确定性.     

莱茵衣藻生长和光合作用对硝基苯的响应

初步研究了不同浓度硝基苯对莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）生长和光合作用的影响．结果表明：不同浓度的硝基苯对莱茵衣藻的生长和光合生理有明显抑制作用，主要表现在其明显降低光合色素的含量、光能转换效率（Fv／Fm）、电子传递速率（ETR）、净光合速率（Pn）等方面；硝基苯对莱茵衣藻的影响主要是通过影响光合色素合成，降低光合作用电子传递，从而降低藻类的光合作用，引起生长的抑制．     

固定化藻类对污水中磷的净化能力研究

采用海藻酸钙凝胶包埋固定藻类,对人工污水进行静态模拟净化试验,研究了蛋白核小球藻、突变衣藻、鱼腥藻和双对栅藻在固定和悬浮状态下对污水中磷的净化效率以及藻类的生长特性。结果表明：固定化藻细胞比悬浮态藻细胞具有生长更趋于稳定、藻类的活性保持时间更长的优势。4种藻类中,小球藻和鱼腥藻在污水中的生长状况更好,较适宜采用海藻酸钙凝胶包埋固定化技术。在固定状态下,蛋白核小球藻、突变衣藻、鱼腥藻和双对栅藻对磷的去除率在第3天达到最大值,分别为39.8%、28.3%、33.0%和30.7%。因此,小球藻更适用于去除污水中的磷,是较为优良的除磷藻种。     

人spindlin 1基因全长cDNA的克隆与定位

利用分子克隆技术和生物信息学手段,克隆并命名了人spindlin 1 基因. 此基因cDNA全长4375?bp,含有236～949 bp完整开放读框,预测编码27?ku 的膜内蛋白. 新基因在核酸序列上与鼠spindlin基因有96%同源,其编码氨基酸序列与鼠spindlin蛋白98%同源. 生物信息学分析表明该基因定位于9q22.1-22.3 区域, 基因组DNA全长为52.3?kb,由5个外显子和4个内含子组成,内含子和外显子之间的剪切完全符合GT-AG法则. 利用绿色荧光蛋白与spindlin 1基因的融合蛋白表达载体转染COS-7细胞表明spindlin 1表达的蛋白定位于胞核,且转染后的细胞中较多见胞核形态的改变,例如出现双核或巨型核.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

Co2+对莱茵衣藻生长及类囊体膜功能的影响

本文用不同浓度的CoCl2处理莱茵衣藻,结果表明：当钴离子浓度大于0.05 mmol/L时,莱茵衣藻的生物量和叶绿素含量显著下降.然后用不同浓度的CoCl2处理莱茵衣藻的类囊体膜,分析了Co2+处理前后类囊体膜的室温荧光发射光谱、DCIP光还原活性以及多肽组分的变化.结果显示：Co2+处理（0.5~4 mmol/L）改变了Chla,Chlb以及蛋白质氨基酸残基的微环境,影响了类囊体膜PSⅡ的供体侧和反应中心,导致类囊体膜上PSⅡ的电子传递被阻断.     

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Human PSF and Identification of its Expression in CHO Cell Line

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况.应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFPNL真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定.将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达.成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达.