λRed技术构建产酸克雷伯氏菌乙酸激酶基因缺失突变株

乙酸是2,3-丁二醇典型代谢途径中的主要副产物之一,并对2,3-丁二醇的代谢产生影响。乙酸激酶(acetate kinase,ack)是乙酸生成途径中的关键酶,敲除ack基因,理论上可以阻断乙酸的产生,从而提高2,3-丁二醇的产量和得率。本文利用λRed技术构建乙酸激酶基因敲除重组质粒p T-LKR,通过酶切、纯化获得线性片段ack L-Kanr-ackR,将其电转化至Klebisella oxytoca HD79中,卡那霉素抗性筛选阳性转化子。结果表明,经PCR及测序验证K.oxytoca HD79乙酸激酶缺失工程菌株构建成功,为后续进一步提高2,3-丁二醇的产量和扩大菌株选择范围奠定基础。     

高产2,3-丁二醇阴沟肠杆菌的诱变筛选及其同步糖化发酵效率的研究

为获得2,3-丁二醇高产菌株,采用两种诱变方法(物理诱变和化学诱变)对阴沟肠杆菌SDM(E1)进行处理。经紫外诱变后筛选出菌株E2,其2,3-丁二醇产量为27.37 g·L~(-1),相比于出发菌株提高11.33%。采用化学诱变剂硫酸二乙酯对E2进行化学诱变后,筛选出菌株E3,2,3-丁二醇产量为37.32 g·L~(-1),相比于菌株E2提高36.32%,相比于E1提高51.77%。以E3为出发菌株、玉米芯为底物进行同步糖化发酵效率的研究,确定玉米芯的最佳预处理条件为温度80℃、时间2 h、碱浓度3%、固液比1∶3;纤维素酶解的初步条件为温度45℃、时间72 h、转速140 r·min~(-1);同步糖化发酵的最佳条件为纤维素酶0.3 g、初始pH 5.7～6.0、温度36℃、底物浓度100 g·L~(-1)(10%),发酵时间72 h,菌株E3的2,3-丁二醇产量可达到35.61 g·L~(-1)。本文研究结果为木质素同步糖化发酵生产2,3-丁二醇的研究提供了菌株材料,并为木质素为底物的同步糖化发酵奠定了技术基础。     

产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca) α-乙酰乳酸脱羧酶基因(BudA)的克隆及生物信息学分析

以Klebsiella oxytoca(K.oxytoca)HD79为出发菌株,根据α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列相似的特点,利用Primer5.0设计一对引物,以K.oxytoca HD79为模板,PCR扩增,获得K.oxytoca HD79基因片段Bud A,此片段经测序显示长度为780 bp,无碱基缺失。利用生物信息学软件对该序列进行了同源性分析、氨基酸组成分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、亚细胞定位分析及二、三级结构预测。结果表明,该片段为K.oxytoca HD79的α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列。对该酶进行的生物信息学特异性分析为其构建产2,3-丁二醇的工程菌株提供一定的理论参考。     

合成2,3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌菌株的筛选及改造

2,3-丁二醇(2,3-BD)是具有广泛工业应用前景的平台化合物,可应用于医药、食品、航天、航空等诸多领域。近年来,随着石油资源的枯竭和人类生存环境不断恶化,人们保护环境的意识有所提高,因此,生物法合成2,3-丁二醇成为了国内外研究热点。但生物法合成2,3-丁二醇的效率问题一直制约着其工业化进程,采用代谢工程的理论及方法,优化及改造菌株代谢途径有望改变这一现状。肺炎克雷伯氏菌作为2,3-丁二醇的生产菌,具有较强的环境适应能力,并且其底物范围广、代谢彻底、副产物较少、转化率较高,是具有工业化生产前景的菌株之一。本文综述了近年来肺炎克雷伯氏菌及其他菌株合成2,3-丁二醇研究过程中的菌株改造及构建方法,这对于其他具有工业应用价值的菌株改造工作具有一定的借鉴意义。     

建立果蝇心脏发育候选基因CG3295的基因敲除系

果蝇CG3295基因是哺乳动物基因RMND5在果蝇中的同源物,其功能未知.利用P转座子敲除技术进行果蝇CG3295基因的敲除研究,将果蝇14234系的P转座子与△2-3系中的转座酶基因组合到同一个体,使P转座子在体内敲掉目的基因.从后代挑选不含P转座子和转座酶基因的500头雄蝇分别与缺失了CG3295基因的测交系交配,从后代筛选获得20个CG3295基因敲除候选系.进一步利用Hand-GFP系使候选系的心脏表达绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下根据候选系是否表现心脏突变表型鉴定敲除系,最后获得了12个表现心脏突变表型的CG3295基因敲除系.     

纤维素产生菌汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3全基因组测序分析

为全面了解汉氏葡糖醋杆菌(Komagataeibacter hansenii,K.hansenii)HDM1-3的发酵特性，为提高纤维素产量提供基因组信息，对其基因组数据进行测序分析。采用PacBio RSⅡ平台对该菌株进行全基因组测序，基因组由1个3 659 612 bp染色体和2个质粒组成，编码3 820个蛋白质，含有7个纤维素合成酶基因。基于16S rRNA的系统发育分析表明了K.hansenii HDM1-3相对于醋酸杆菌科菌株的进化地位。在基因组中，共注释到碳水化合物活性酶88个。通过KEGG注释到代谢通路相关基因共3 132个，其中碳水化合物代谢相关基因287个。通过基因组测序获得了K.hansenii HDM1-3完整的基因组信息，为改造该菌株提供了基因组学基础。     

PadR对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成及转运相关蛋白表达的影响

为研究padR基因表达对须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)次级代谢产物生物合成及相关蛋白表达的影响,在对须糖多孢菌基因组测序结果的基础上,从基因组中克隆了padR基因上、下游同源臂,利用融合PCR将硫链丝菌素抗性基因插入上、下游同源臂之间,将融合片段与穿梭载体pOJ260连接,构建敲除载体pOJ260-UHA-tsr-DHA。通过接合转移将其导入野生型须糖多孢菌中,通过同源臂双交换获得须糖多孢菌敲除菌株S.pogona-ΔpadR。经HPLC检测分析,敲除菌株次级代谢产物丁烯基多杀菌素产量与原始菌株相比提高了27.3%,且有7个转运相关蛋白出现表达上调。这一研究表明padR基因的敲除能够有效促进须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成。该研究对优化须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成途径具有一定的指导意义,为研究padR基因表达在链霉菌次级代谢产物合成中的作用打下了基础。     

跨界基因沉默菌株的快速构建及对靶标基因干扰能力的检测

"跨界基因沉默"是一种利用大肠杆菌在哺乳动物细胞中传递小干扰RNA并引起基因沉默的新颖技术,具有实用、稳定和低成本等优点.该技术通过构建一种能转录出短发夹RNA(shRNA)的大肠杆菌,而这种大肠杆菌产生的shRNA能靶向哺乳动物细胞中的特定基因,从而引发RNA干扰(RNAi).本文用RecA同源重组的方法将跨界基因沉默质粒的工作元件快速地整合到大肠杆菌的染色体DNA上,构建了跨界基因沉默菌株.通过吖啶橙染色实验证明了跨界基因沉默菌株能够入侵哺乳动物细胞,最后Western blot结果表明跨界基因沉默菌株可以对靶标基因产生干扰作用.该技术的完善将进一步促进工程菌的研发和利用.     

CRISPR/Cas9系统对斑马鱼fhl1a基因敲除有效性的研究

为研究fhl1a基因在心脏发育中的作用,利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼fhl1a基因.在斑马鱼fhl1a基因的三号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体.将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中以期实现对目的靶基因fhl1a的敲除.随后收集部分72 h胚胎进行PCR检测和产物直接测序,确定有无突变.为进一步验证突变是否可稳定遗传,选择具有敲除了的F_0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F_1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序分析.结果显示F_1获得了不同程度的插入、缺失等突变类型.研究结果证明所设计的fhl1a基因CRISPR/Cas9敲除系统能在斑马鱼体内有效地形成基因突变,该突变能稳定地遗传到下一代个体,这为进一步研究fhl1a基因在心脏发育中的具体调控机制打下了基础.     

反硝化细菌Y39-6的基因组及生理生化特征研究

菌株Y39-6是从哈尔滨周边地区地下水中分离的一株假单胞菌，具有异养反硝化和自养脱氮能力，由于假单胞菌属内的菌种鉴定存在复杂性，对菌株Y39-6的具体分类仍有争议。通过获得菌株Y39-6的全基因组序列，进行比较基因组学分析，分析了菌株的碳源利用和脂肪酸含量特征，对菌株的生理生化特征进行了系统研究。发现菌株Y39-6与模式菌Pseudomonas veronii CIP 104663T的基因组相似性更高，G+C的含量接近，共有基因数量最多，为368个，碳源利用特征相似，可以确定菌株Y39-6属于Pseudomonas veronii菌种。菌株Y39-6有15个特有基因，主要脂肪酸为C16∶0和C17∶0 cyclo,含量分别为22.05%和21.25%,与Pseudomonas veronii菌种的其他菌株相比，存在明显的特异性。通过以上研究，确定了菌株Y39-6的分类地位和生物学特征，为菌株Y39-6的进一步应用提供了生物学参考依据。     

NTG和UV复合诱变选育紫杉醇高产菌株的研究

对紫杉醇产生菌HD1-3的孢予分别进行了紫外线照射(UV)、亚硝基胍(NTG)和UV NTG复合诱变处理,筛选制霉菌素抗性突变株.试验所确定的Nodulisporium sylviforme紫杉醇产生菌HD1-3孢子诱变的适宜条件为:将孢子悬液经过3.0 mg·mL-1 NTG、处理20 min后,在电磁搅拌下,用紫外灯(30 w,距离30 cm)照射处理45 s.共筛选出17株正突变株.经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产紫杉醇的诱变菌株——UN25-3,其紫杉醇产量从出发菌株的(232.73±4.61) μg·L-1提高至(327.14±7.63) μg·L-1.     

东北红豆杉细胞GGPPS基因cDNA的克隆

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶是红豆杉细胞紫杉醇生物合成途径中的关键酶。试验采用RT-PCR技术从东北红豆杉中克隆GGPPS基因片段,将GGPPS基因片段与pMD20-Tvector连接,转化E.coli DH5α,对阳性克隆进行序列测定。生物信息学分析结果表明,获得GGPPS基因片段长度为371 bp,与GenBank中收录的GGPPS同源性达到99%。为从内生真菌紫杉醇生物合成途径中克隆关键酶基因和高产紫杉醇基因工程菌株的构建提供了借鉴。     

利用Ti质粒介导的二元载体法向小麦导入几丁质酶 …

以小ＮＰＦＤ、９４－１６７、鄂恩一号３个品种的幼胚，幼穗为受体材料，利用Ｔｉ质粒介导的二元载休不幸针含有几丁质酶基因的质粒ｐＢｃｈ导入小麦，经过抗性筛选，ＰＣＲ检测，获得一株基因小麦，证实了外源几丁质酶基因已整合到小麦基因组中。     

HIV-1型Nef基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

为了构建艾滋病毒HIV-1型Nef基因重组表达载体,利用PCR从p NL4-3质粒上扩增HIV-1型Nef基因,获得Nef基因完整的编码区,构建可表达Nef蛋白的p EB-myc-nef重组表达载体.经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染SW480细胞,通过Western Blot技术检测Nef蛋白的瞬时表达.为了建立稳定表达Nef基因的SW480细胞系,采用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法,筛选出单克隆细胞系.扩大培养克隆细胞后,通过RT-PCR和Western Blot分别检测Nef的mRNA转录水平及蛋白表达水平,经长达60 d的传代,最终获得稳定表达Nef基因的SW480细胞系,为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.     

东北红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA克隆及其与紫杉醇产生菌基因组DNA的Southern杂交(英文)

为进一步研究紫杉二烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RT-PCR技术从东北红豆杉(Taxus cuspidata)树叶中获得了紫杉二烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMT-easy vector上,并转化到E.coliJM109中,经EcoRI酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,获得紫杉二烯合成酶基因片段长度为909 bp,编码303个氨基酸,与GenBank中收录的紫杉二烯合成酶的同源性达到98%;对获得的紫杉二烯合成酶基因和紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA进行了Southern杂交。结果初步证实了紫杉二烯合成酶存在于通过内生真菌发酵生产紫杉醇的生物合成途径中。为利用分子生物学手段研究通过内生真菌发酵生产紫杉醇生物合成的代谢调控和构建高产紫杉醇基因工程菌株提供了强有力的理论指导。     

基于细胞色素P450单加氧酶介导的4-甲酚氧化降解途径的天麻素生物合成

为实现天麻素的微生物异源生产,将谷氨酸棒状杆菌中4-甲酚降解相关基因cre HIJEFD和药用植物红景天来源的尿苷二磷酸糖基转移酶基因ugt分别克隆至载体pRSFDuet-1和p ACYCDuet-1,转化大肠杆菌后获得重组菌株S1.在S1中诱导关键酶表达后,外源添加4-甲酚,生物转化后对产物进行定性和定量分析.最终以5mmol/L 4-甲酚为底物,重组菌株S1在30℃诱导培养48 h后转化产物中有天麻素生成,产量达到1.5 mmol/L,摩尔转化率为30.3%.本研究实现了从4-甲酚到天麻素的生物转化,可为芳烃化合物降解与天然药物分子生物合成相偶联提供新的思路,并且具有一定的产业化应用前景.     

四株大肠杆菌质粒的染色体诱动作用初报

从动物粪便中分离到四株大肠埃希氏菌142A、41A、193C、199T所携带的抗药性质粒pTF1、pTF6、pTF7、pTF8。所携带的抗性基因pTF1和pTF6均为人Ap~r、Tc~r、Sm~r;pTF7为Ap~r、Tc~r、Sm~r、Cm~r;pTF8为Tc~r和Sm~r。它们均可以10~(-3)—10~(-5)的转移颖率转移到不同品系的大肠杆菌中去。抽提各质粒的DNA并进行转化实验,然后再进行接触转移实验均获得予期结果。我们将各转移子E.coli K12W1485(pTF1、pTF6、pTF7、pTF8)分别作为供体,再分别与E.coli XACF-△(lacpro)arg-R if~r进行杂交实验以pro、arg为双选择标记;与E.coli62pro~-、his~-、trp~-、Nal~r进行杂交实验以pro、trp作为双选择标记;与E.coliK12W1177leu~-、thr~-、thi~-、Str~r进行杂交实验以leu、thr作为双选择标记结果均获各重组子。实验说明抗药性质粒pTF1、pTF6、pTF7、pTF8均具有诱动其宿主染色体转移的功能。杂交实验能获重组子,原因是供体染色体在质粒诱动作用下能够向受体转移,进而与受体染色体发生重组。有关质粒的作用及转移机制有待于深入研究。     

nodD基因的克隆及其导入大豆根瘤菌工程菌株的构建

以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA作为模板,采用PCR技术,克隆结瘤基因nodD编码区序列;利用DNA重组技术,将nodD基因连到lac启动子的下游,通过luxAB基因标记的质粒载体pTR102构建表达载体pTR102-Plac-nodD,采用三亲本杂交的方式,将构建的表达载体转化土著大豆根瘤菌,构建转基因工程菌株,为研究转基因工程菌株对大豆结瘤能力的影响提供依据。     

假单胞菌Y5-11的分离筛选及比较基因组学研究

菌株Y5-11是从哈尔滨周边地区地下水中分离的一株假单胞菌,具有较高的自养脱氮能力。菌株Y5-11的16S rRNA基因序列与模式菌Pseudomonas koreensis Ps 9-14^T高度同源(99.72%)。获得了菌株Y5-11的全基因组序列,采用比较基因组学分析了菌株Y5-11的碳源利用和脂肪酸含量特征,对菌株的生理生化特征进行了系统研究,发现菌株Y5-11与模式菌Pseudomonas koreensis Ps 9-14^T在碳源利用上较为接近,但两株菌株在生长温度和硝酸盐还原方面存在差异。菌株Y5-11有17个特有基因,其在脂肪酸种类及含量上与其他菌株相比,存在明显的特异性,主要脂肪酸为C16:0和C17:0 cyclo,含量分别为19.37%和21.09%。通过以上研究,确定了菌株Y5-11的分类地位和生物学特征,为菌株Y5-11的进一步应用提供了生物学参考依据。     

斑马鱼HAS2基因的克隆、抗体制备及分析

HAS2是斑马鱼心脏发育的一个标志基因,为了利用斑马鱼动物模型进一步研究HAS2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼HAS2基因的片段.将所得的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-HAS2)转化大肠杆菌(E.coli)BL21,IPTG诱导表达GST-HAS2融合蛋白;通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体活性.生物信息学分析结果表明:斑马鱼HAS2基因的开放阅读框含有1658 bp,编码552个氨基酸;SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约为4.5×104;Western blotting分析表明,制备的抗体具有良好的特异性.