黄曲霉产胞外β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件优化

研究发现一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的黄曲霉菌株,优化了其产酶条件并考察了粗酶潜在的工业应用价值。依次采用单因素法和响应面分析法优化该菌发酵产酶条件,得到其优化产酶条件:麸皮19g/L、磷酸氢二铵30g/L、吐温-60 21g/L、NaCl 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、KH₂PO₄ 0.75g/L、培养基初始pH值8.0、培养温度38℃、培养时间6d。在此条件下,黄曲霉能够分泌的最高胞外β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活达155.9U/mL。水解研究发现,该酶能高效降解大麦粉和燕麦粉中的β-葡聚糖,并直接生成葡萄糖。这些结果表明,黄曲霉能高效分泌β-1,3-1,4-葡聚糖酶,且该酶具有较强的工业应用前景。     

β-葡聚糖酶对β-1,3-葡聚糖的最佳酶解条件

研究β-葡聚糖酶对β-1,3-葡聚糖酶解的最佳条件.采用DNS显色法分别测定底物质量浓度、酶质量浓度、酶解的温度、pH值对酶解产物还原性糖质量分数的影响;在单因素基础上做正交优化试验,再对酶解时间进行考察.结果表明,最佳酶解条件为糖质量浓度1.4 mg/mL,酶质量浓度14 mg/mL,温度55℃,反应pH值为5.5,...     

多孔陶瓷和浮石载体固定化重组大肠杆菌表达β-葡聚糖酶

分别以多孔陶瓷和浮石为载体吸附法固定重组大肠杆菌(Escherichia coli JM 109-pLF3)表达β-葡聚糖酶.研究了载体量、转速、温度、pH等条件对固定化细胞产酶的影响.结果表明,以多孔陶瓷和浮石为载体固定化细胞发酵可以大大提高产酶效率,二者均可有效吸附重组大肠杆菌,发酵液的酶活分别达到97 U/mL和73 U/mL,比悬浮液体发酵提高了2~3倍;载体量、转速、温度对产酶的影响较大,多孔陶瓷和浮石的最佳装载量分别为20 g/100 mL培养基和8g/100 mL培养基,最佳转速为200 r/min,最佳培养温度为37℃;发酵液pH值对细胞产酶的影响较小,pH值6.0~8.0之间发酵液的酶活力变化不大.重复批次发酵结果表明,固定化发酵具有良好的重复使用能力,在连续10批次实验中,多孔陶瓷载体和浮石载体固定化发酵的酶活力分别不低于91 U/mL和72 U/mL.     

木霉产生的β-1,3-葡聚糖酶研究进展

木霉产生的β-1,3-葡聚糖酶是防治植物真菌性病原菌的主要机制之一，它能降解真菌的细胞壁。本文着重介绍了β-1,3-葡聚糖酶分子生物学方面的特性．以及在生物防治和基因工程方面的研究进展。     

重组大肠杆菌发酵生产β-葡聚糖酶工艺条件研究

通过对重组大肠杆菌JM109-pLF3摇瓶发酵生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶工艺条件的研究,得出最佳培养条件为:温度39℃,摇床转速150 r/min,培养基装量20 mL/250 mL,培养基初始pH 6.7,种子培养时间16 h,接种量1%.在最佳培养条件下,发酵30 h酶活力达到最大值481.41 U/mL.最优条件下摇瓶恒速补加氮源对酶活的提高贡献较大,且适当提高流加量对促进产酶效果更明显,酶活力可达628.30 U/mL,为初始时的2.1倍.     

产β-葡聚糖酶的黑曲霉液态发酵优化的研究

应用β-葡聚糖刚果红营养平板法(GCN平板法),从土壤中筛选产β-葡聚糖酶的丝状真菌。温度、初始pH、平板的厚度都会影响产β-葡聚糖酶的霉菌分解底物所形成水解圈的大小及透明度。选用筛选的黑曲霉做摇瓶实验,通过正交试验,确定最佳培养基:大麦粉2g,麸皮2g,(NH4)2SO40.2g,豆饼粉1g;最佳培养条件是:温度为30℃,初始pH5.0,装样量50mL。     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

运用选择性培养基LBCMC从环境土样中分离得到一株能利用羧甲基纤维素的芽孢杆菌Bacillus sp．NW-2004a，并运用“鸟枪”克隆法构建了其基因组文库，且从此基因组文库中筛选得到两个阳性克隆．对其中一阳性克隆中插入的DNA片段（命名为GLUD）进行序列测定，发现了一长度为2502bp的开放阅读框（ORF），可编码834个氨基酸．BLAST分析结果表明，该基因与Bacillus sp．KSM-S237来源的纤维素酶基因AB018420具86％相似性，所编码的多肽与Bacillus sp．KSM-64来源的β—1，4-内切葡聚糖酶具89％的相似性，故该基因是一新发现的β—1，4-内切葡聚糖酶基因．该序列已收录于Genebank，登录号AY663839．另外，以cpoI and NotI限制性内切酶双酶切衍生于质粒pGEX的大肠杆菌表达载体pHBM625，然后将经T4 DNA polymerase处理后的β-1，4-内切葡聚糖酶基因克隆至载体pHBM625中得到重组质粒pHBM625Glu，最后通过平板检测及SDS—PAGE凝胶电泳，均检测到该基因在大肠杆菌XL10-Glod中的表达．     

嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

首先通过引物设计扩增嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶基因,然后采用Not I和Xho I双酶切目的基因与载体pPICZα-A,通过T4连接酶连接后转化DH5α菌株,挑取阳性克隆进行测序,测序正确阳性克隆放大培养,大量提取质粒,并采用限制性内切酶Sac I线性化质粒,电转化感受态酵母细胞,经培养后挑选转化子分别对应点种到MM、MD平板,并利用ZeocinTM获得多拷贝重组子,最后经甲醇诱导,并于48、54 h取样,经SDS-PAGE分析,结果表明整合嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶的毕赤酶母工程菌株构建成功.     

木霉产生的β-1,3-葡聚糖酶

木霉产生的β-1,3-葡聚糖酶是防治植物真菌性病原菌的主要机制之一,它能降解真菌的细胞壁,本文着重介绍了β-1,3-葡聚糖酶分子生物学方面的特性,以及在生物防治和基因工程方面的研究进展.     

响应面法优化菌株Serratia proteamaculans sp. L 3产冷活性β-半乳糖苷酶

为了开发工业用酶,在前期菌株筛选的基础上,利用Design-Expert软件,通过Plackett-Bru-man设计与响应面法(RSM)相结合的实验统计方法实现对Serratia proteamaculans sp.L 3菌株产冷β-半乳糖苷酶培养基成分的优化.Plackett-Burman设计筛选出3个显著影响因子:K2HPO4,MgSO4和NaCl,应用中心组合设计和响应面分析确定产酶的最优组合为:K2HPO40.15 g·L-1,MgSO40.50 g·L-1,NaCl 0.76 g·L-1,此时预测的最高A420为0.370 4.经过验证实验,结果表示最佳产酶培养基成分条件下,优化后降解ONPG的能力提高了1.1倍.本研究为微生物β-半乳糖苷酶的后续工业化应用提供理论依据.     

病原真菌细胞壁对棉花β-1,3-葡聚糖酶的诱导

从引起棉花红腐病的病原真菌——串珠镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）的菌丝中制备了细胞壁水解产物,测定了其对棉花叶片和棉花组培细胞的β－１,３－葡聚糖酶的诱导能力．结果表明,串珠镰孢菌菌丝细胞壁水解产物可以诱导棉花细胞的β－１,３－葡聚糖酶的活性增加．诱导过程需要钙离子．用水杨酸预先作用棉花组培细胞可以提高细胞对病原菌菌丝细胞壁水解产物的诱导敏感性,使β－１,３－葡聚糖酶和另一类与植物抗病反应有关的酶（过氧化物酶）达到最大活性的时间提前．     

水稻β-1,3-葡聚糖酶疏水簇特性的研究

研究了41个水稻β-1,3葡聚糖酶的疏水簇(HC)的结构特点、HC的疏水氨基酸的突变倾向、密码子使用类型与偏好、为同种氨基酸二连体组合编码的密码子二连体组合使用类型与偏好.研究结果显示,水稻β-1,3葡聚糖酶至少有20个保守性较高的基本的HC,HC内至少含有≥1个疏水核心或有≥2个高度保守的疏水氨基酸位点.HC内似乎有I易向L、V、F突变,M易向I、V突变,W易向F突变,而反向突变较难的倾向.HC中的疏水氨基酸位点和为丙氨酸（A）编码的密码子使用频率与水稻基因组的统计数据出现明显偏差,为部分同种氨基酸二连     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ在大肠杆菌中的重组表达及重组酶性质测定

将不含信号肽的瑞氏木霉内切葡聚糖酶II(Cel5A)的cDNA克隆到pET-28a(+)表达质粒上,与其N末端6个组氨酸标签序列融合,构建成pET-28a(+)-egl2表达质粒,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达.利用低温诱导策略,成功表达出活性重组蛋白.Western blot 结果显示重组Cel5A相对分子分量大约为43 000.进一步对重组Cel5A进行Ni-NTA亲和层析柱纯化并对其进行酶学性质测定,结果显示以羧甲基纤维素钠为作用底物时重组酶最适作用pH为4.5,最适作用温度为60℃;重组酶热稳定性较好,在65℃及以下保温1.5 h,活性仍相当稳定.Mn2+对Cel5A的酶活有促进作用,Fe3+和Cu2+有抑制作用,其它金属离子和EDTA对酶活没有明显影响.底物特异性研究表明,重组Cel5A只能水解混合键葡聚糖和羧甲基纤维素钠,对混合键葡聚糖的水解能力是其对羧甲基纤维素钠水解能力的6.7倍,但对微晶纤维素、Glass microfiber filters、木聚糖、阿拉伯木聚糖和木葡聚糖没有水解作用.     

纺织用嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达、纯化与酶学性质

首先从Pyrococcus horikoshii中克隆出编码热稳定性的内切纤维素酶基因,以载体pet21a为表达质粒,构建重组质粒pet21a-1171,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys中进行表达,目的基因得到明显的可溶性表达,通过加热变性处理和离心后,重组酶纯度达到80%以上,随后对加热处理后的粗酶液进行简单酶活测定,结果表明,最适反应温度为95℃,与国外文献报道相一致,嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶成功得到重组可溶性表达。     

β-1，3-葡聚糖抗实验性胃溃疡作用研究

β-1,3-葡聚糖对小鼠水浸应激性胃溃疡、乙醇或阿司匹林损伤性胃溃疡、大鼠幽门结扎性胃溃疡和乙酸腐蚀性胃溃疡等有非常显著的预防或治疗作用(p＜0.01～0.001),而且均有良好的剂量效应关系.其中小分子β-1,3-葡聚糖的抗溃疡作用优于大分子β-1,3-葡聚糖;β-1,3-葡聚糖抗溃疡作用机制与其对胃酸和胃蛋白酶分泌的影响无关,而可能与其对胃粘膜的直接接触和对免疫细胞的调节作用有关.     

啤酒废酵母中RNA和β-(1,3)-D-葡聚糖的综合提取

为实现RNA和β(1,3)-D-葡聚糖的综合提取,通过碱-酶提取法和优化稀碱提取条件,研究了温度、NaOH质量分数对RNA提取的影响.结果表明:温度为100℃,NaOH质量分数为4％时,提取率为7.65％,纯度为70.24％.进一步比较中性蛋白酶和碱性蛋白酶对β-(1,3)-D-葡聚糖提取的影响,发现中性蛋白酶得到的产物较多,纯度较高,实验结果为进一步的工业化生产奠定了基础.     

β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株H9中,克隆到了编码葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,转化至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中进行表达,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.实验结果表明：该基因大小为1980bp,共编码659个氨基酸,在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;该酶的相对分子质量约为73000,由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成,其在不同温度和pH值下的活力和稳定性与原始菌株的比较接近.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

响应面法优化黑曲霉产β-葡萄糖苷酶培养基的研究

为获得黑曲霉Aspergillus niger M85菌株较高的β-葡萄糖苷酶酶活,本文采用响应面法对该菌株产β-葡萄糖苷酶关键发酵过程参数进行优化。Plackett - Burman试验结果表明,麸皮和MgSO4?7H2O的浓度对产酶结果影响显著。采用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,得到麸皮浓度为17 g/L,MgSO4?7H2O浓度为8 g/L,结合中心组合实验及响应面法分析建立了以β-葡萄糖苷酶酶活力为响应值的二次回归方程模型：Y=-19.1057+0.4526X2+ 3.8260X5-0.02775X2X5- 6.3569×10-3X22-0.2085X52 。对方程求极值点得到优化的发酵过程参数：麸皮浓度为18.345 g/L,MgSO4?7H2O浓度为7.963 g/L。在优化后的发酵条件下培养4天,菌株产β-葡萄糖苷酶活力可达0.2640 U/mL,比优化前提高了61.97%。预测模型可靠性高,可应用于β-葡萄糖苷酶发酵条件的优化。产酶进程结果表明：发酵5天后β-葡萄糖苷酶活力可达到最高值0.3334 U/mL,还原糖浓度仅为0.49g/L。