GST—hBTLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBTLyS（human Blymphocte stimulator）基因序列设计合成特异性引物。用RT－PCR从人外周血淋巴细胞扩增出858bp的hBLyS基因，并将其插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达质粒pGEX-4T-1/hBLyS.把此重组质粒转化大肠杆菌BL21，经用IPTG诱导，表达出GST－hBLyS融合蛋白。     

GST—EGF融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

将小鼠ＥＧＦ基因克隆至谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ,转化大肠杆菌ＤＨ５α,获得高效表达,融合蛋白ＧＳＴ－ｍＥＧＦ经Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ－ＧＳＨ亲和层析柱纯化和凝血酶消化获得有免疫活性的ｍＥＧＦ,表明ＧＳＴ融合基因表达系统不仅能提高表达产物的稳定性也有利于产物的纯化     

拟南芥NOA1蛋白的原核表达和分析

通过构建AtNOA1的GST融合表达载体,在E.coli中表达AtNOA1蛋白,并分析不同诱导条件对AtNOA1蛋白表达的影响.结果表明,22℃是AtNOA1表达的最适诱导温度,而IPTG浓度在一定条件下变化对AtNOA1表达量无明显影响.     

小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % ,表达产物为包涵体     

GST-hBLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBLyS (humanBlymphocytestimulator)基因序列设计合成特异性引物 ,用RT_PCR从人外周血淋巴细胞扩增出 85 8bp的hBLyS基因 ,并将其插入到融合蛋白原核表达载体 pGEX_4T_1中 ,得到重组表达质粒pGEX_4T_1/hBLyS。把此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,经用IPTG诱导 ,表达出了GST_hBLyS融合蛋白。     

人工合成人表皮生长因子在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中高产表达人表皮生长因子（hEGF），并探索提高外源基因在pET-3c：BL（DE3）表达系统的表达水平的途径。方法：根据大肠杆菌对密码的偏爱性，合成编码53个氨基酸的hEGF基因，分别以非融合蛋白和融合蛋白两种方式表达。计算机两者mRNA的翻译起始区（translation initiation region，TIR）的结构。结果：融合蛋白表达产量为27％，非融合蛋白的表达用SDS－PAGE检测不到，两者均具有促细胞增殖的活性。融合蛋白mRNA的TIR的△G值较非融合蛋白的高。结论：在pET－3c：BL21（DE3）大肠杆菌表达系统中，以融合蛋白方式表达人表皮生长因子，表达效率高且不影响其活性，此外，mRNA的TIR的结构可能是影响外源基因在本研究的表达系统的表达效率的一个重要因素。     

甘薯储藏蛋白(sporamin)A基因在大肠杆菌中的表达研究

利用基因重组技术,将ＰＣＲ扩增获得的甘薯储藏蛋白Ａ基因的成熟肽编码区序列,插入到高效表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＢ中,构建成重组表达质粒ｐＴＨＳＰＯ－Ａ,用限制酶切和ＰＣＲ分析均表明重组质粒与预期结果相符,用ＩＰＴＧ诱导重组质粒转化的大肠杆菌ＴＯＰ１０。菌体总蛋白经１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一个大小为１０ｋＤ的蛋白质带,其分子量比预期值小。     

鼠心钠素基因在大肠杆菌中的融合表达及产物的分离纯化

将克隆有化学成分的鼠心钠素基因的质粒ＰＸＺ－ａ－ＡＮＰ－５９０改建成质粒ＰＬＨ２８０,转化大肠杆菌表达融合蛋白ＬａｃＺ－２８０－ａ－ＡＮＰ。     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结     

人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的融合表达

将人碱性成纤维细胞生长因子ｈｂＦＧＦ基因克隆于质粒ｐＧＥＸ，构建了融合蛋白ＧＳＴ－ＦＧＦ的表达质粒ｐＧＥＸ－ＦＧＦ，将ｐＧＥＸ－ＦＧＦ转化大肠杆菌ＤＨ５α，诱导培养后测得融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的２２％，每升发酵液中可产生１８８ｍｇ ＧＳＴ－ＦＧＦ。     

大肠杆菌SD序列与基因表达水平的关系

依据基因表达水平的理论预测方法从１３７３个大肠杆菌基因中选出了７３个甚高表达基因和１００个甚低表达基因,研究了这两类基因编码区起始密码子ＡＴＧ前－１到－２１位点（包含ＳＤ序列）的碱基构成与基因表达水平的关系。结果表明,ＳＤ序列中的富嘌呤区（约在－７到－１２位点）Ｇ和Ｔ的概率分布曲线中心到ＡＴＧ的距离（记为ＬＨ）与基因表达水平有明显的关系。甚高表达基因ＬＨ约为１０,甚低表达基因的ＬＨ约为８,另外在－     

蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中的克隆与表达

根据蚯蚓纤溶酶最佳组分的N-末端氨基酸序列设计简并引物,以蚯蚓cDNA为模板,获得该组分蛋白质的部分编码序列(AF432224,GenBank 登陆号).BLAST相似性分析表明,该序列与U25643和U25648的部分序列相似性达91%, 根据5' 和3' 末端保守序列设计引物,经PCR获得全长cDNA编码序列.将该序列插入pTBY-11质粒,转化大肠杆菌,表达蛋白以包含体形式存在.     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

小鼠睾丸特异表达新基因(mtLR1)在大肠杆菌中的表达

根据已经克隆的mtLR1基因序列,采用RT-PCR的方法获得mtLR1基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pMAL-P-2x中,得重组质粒(pMAL-P-2x/mtLR1)并转化大肠杆菌(E．coli)DH5α．经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,重组蛋白得到了正确表达,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的52％,分子质量约为73 kDa。mtLR1蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础。     

外源基因在大肠杆菌中表达的优化

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但基因的表达受多种因素的影响,现就各种影响因素综述了外源基因表达的优化策略,这将有助于采取有效方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率.     

人骨保护素N端片段在大肠杆菌中的表达及其活性分析

OPG成熟肽N端D1～D4结构域仅由2个外显子编码.以人基因组DNA作为模板,PCR分别扩增骨保护素基因外显子2和外显子3,再以2种PCR产物的混合物作为模板,采用重组PCR法得到N端D1～D4域编码序列,使该序列与载体pET42a部分序列相连,然后克隆人载体pET42a进行表达,SDS-PAGE表明产物主要以包涵体形式存在,可被抗OPG多克隆抗体识别.Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化融合蛋白GST-hOPG(D1-4),Xa切割祛除担体蛋白及进一步分离纯化.采用破骨细胞样细胞诱导分化实验来检测重组蛋白的生物活性,证实该重组蛋白可以抑制OLC的生成.     

麻疯树逆境蛋白(curcin 2)基因的原核表达

将编码麻疯树逆境蛋白curcin 2成熟蛋白的M片段和编码前体蛋白的P片段分别定向克隆到质粒载体pQE-30、pQE-31后,获得重组质粒pQE-30-M、pQE-31-P.该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株,经IPTG诱导后M片段表达的蛋白质主要以包涵体形式存在,蛋白质的表达量与IPTG浓度及诱导时间有关.重组蛋白可与RGS-His抗体及curcin抗体分别发生专一性抗原抗体反应并被His TrapTMHP柱亲和纯化.体外抗真菌活性实验表明,复性处理后的curcin 2融合蛋白使玉米弯胞杆菌[Curvul     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。     

枯草杆菌启动基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以大肠杆菌启动基因选择载体pHE5为载体,枯草杆菌染色体DNA为供体,克隆了一批启动基因功能片段,带克隆片段的重组质粒在大肠杆菌中表现不同的四环素抗性水平,其中50%在100μg/ml以上,12%达到200μg/ml。对其中一个转化子进行质粒检测和分析,获得一个重组质粒pHE273,经酶切分析证明,克隆的强启动基因位于2.2kb的EcoRI-HindⅢ片段上。