不同试剂盒提取质粒中内毒素水平的比较

目的比较几种不同质粒提取试剂盒提取质粒中内毒素水平。方法选用6种市售商业化试剂盒:QIAGEN质粒小提试剂盒Plasmid Mini Kit(12123),QIAGNE无内毒素质粒大提试剂盒EndoFree PlasmidMaxi Kit(12362),康为世纪高纯质粒中提试剂盒(CW0502),A厂家无内毒素质粒中提试剂盒,B厂家无内毒素质粒小提试剂盒,C厂家无内毒素质粒小提试剂盒(BSC01S2D)。分别提取质粒DNA,应用鲎试剂显色基质法和凝胶法检测所提质粒中内毒素水平。结果6种试剂盒提取质粒得率、A260/A280及A260/A230值均较好,但内毒素水平各不相同,其中各厂家标明无内毒素试剂盒提取质粒中内毒素水平相对较低,QIAGEN无内毒素质料大提试剂盒提取的质粒中内毒素小于0. 125 EU/μg。结论6种质粒提取试剂盒使用时应根据实际情况进行选择。     

耐盐细菌质粒的研究

本实验以1株耐盐细菌My23（耐18％NaCl）作为研究对象,采用碱裂解法对其进行质粒提取,结果表明可以提取得大小2个不同质粒;改变常规提取方法中的部分环节,如加入STE清洗菌体的培养基成分,溶菌酶的使用,以及加入碱裂解液Ⅰ后静置20min,对该耐盐菌质粒的提取有较好的作用。经SDS法将小质粒消除后的菌株与野生型菌株的耐盐功能比较,发现提取出的小质粒与耐盐无关。将大肠杆菌DH5α制备成感受态细胞,将耐盐菌的质粒进行转化,结果进一步表明耐盐性状与质粒没有关系。     

HIV-GAG质粒DNA疫苗的纯化工艺

采用中空纤维超滤浓缩、 离子交换介质和复合模式凝胶过滤介质纯化获得了HIV-GAG药用级质粒DNA疫苗, 并对菌体培养、 菌体裂解、 粗提分离和柱层析等环节进行研究. 实验结果表明, 产品基本符合药用级的质粒DNA要求.     

一种简便快捷的植物线粒体质粒DNA的提取方法

介绍了一种从植物材料中提取线粒体质粒DNA的方法,该方法不需要密度梯度离心和有机溶剂油提,整个提取过程可在较短时间内完成,该方法简便,快捷,效果好,对拷贝数低的线粒体质粒DNA得率高。     

酵母质粒的快速提取法

早期制备酵母2μm质粒的方法多是采用机械破碎细胞,所得到的质粒DNA中含染色体DNA碎片较多,得率也不高。Cameron和Devenish采取碱裂解法要求严格控制溶液pH值在12.45,因之不易操作,使此法运用受到限制。近年来,有人采用先提取酵母总DNA,再以酸酚法抽提质粒,仍然要求严格地保持提取液的pH值。用微量快速提     

AML1-ETO基因表达质粒的构建

t(8；21)染色体易位是导致急性髓系白血病的最常见的发病机制，AMLl-ETO是t(8；21)易位所产生的融合基因．为了研究在细胞中能与AMLl-ETO相互作用的蛋白质，利用PCR、酶切、连接、转化、提质粒等分子生物学技术，首先将该基因构建于质粒中，然后转染大肠杆菌，并在大肠杆菌中得到扩增，为进一步深入研究打下基础，本次实验所构建的质粒经测序表明，AMLl-ETO融合基因以正确的阅读框重组转染入载体，并在大肠杆菌中得到扩增．     

大肠杆菌guaC基因的克隆及高效表达

以E.coli MC4100染色体DNA为模板使用PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因guaC，该基因全长1044bp，编码相对分子质量为37ku的蛋白质。将该基因直接克隆于PET—16b质粒的T7启动于下游，得到质粒pEXP1。转化E．coli BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明，鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的80-85倍。     

类人胶原蛋白工程菌质粒稳定性研究

目的研究基因重组大肠杆菌补料分批发酵生产类人胶原蛋白过程中质粒稳定性。方法通过平板复制法,观察质粒稳定性在不同生长周期、卡那霉素浓度和不同比生长速率中的变化。结果质粒稳定性受生长周期、卡那霉素和比生长速率的影响。在μ为0.15、卡那霉素浓度为0.005g/L的情况下,工程菌生产效率最理想。结论通过控制发酵过程中的质粒稳定性可以有效地提高菌体产量和目标蛋白产量。     

氧化硫硫杆菌质粒pTt12复制原点片段分离及其重组质粒pSDT125转移性能

氧化硫硫杆菌重组质粒ｐＳＤＴ１２５在ＲＰ４质粒的带动下以高出ｐＢＲ３２５两个数量级的频率在大肠杆菌之间转移．转移后,ＲＰ４和ｐＳＤＴ１２５以分离的形式共存于接合转移子中．该质粒不能被ＳＭ１０菌株染色体上的ｔｒａ基因带动转移．以ｐＳＤＴ１２５质粒为基础,通过亚克隆构建了两个质粒ｐＳＤＴ１２５０,ｐＳＤＴ１２５１．二者可以被ＲＰ４质粒带动在大肠杆菌之间转移,转移频率与ｐＳＤＴ１２５相近,没有明显降低．还构建了含有氧化硫硫杆菌质粒ｐＴｔ１２片段的穿梭质粒ｐＳＤＭ２１１,可以被ＲＰ４带动在大肠杆菌与氧化硫硫杆菌之间转移．通过限制性内切酶分析,初步将ｐＴｔ１２的复制原点确定在３．０ｋｂ的片段内．     

两种盐对质粒DNA提取的影响

随着基因治疗及基因疫苗的不断发展,质粒的需求量迅速增加。通过以pcDNA3为目的产物,考察了在其提取过程中硫酸铵和氯化钙的加入对pcDNA3收率的影响和对杂质的去除效果。实验发现:硫酸铵和氯化钙的加入都可以明显降低质粒提取液中蛋白质、RNA杂质的含量;但是氯化钙在降低蛋白质和RNA含量的同时也降低了质粒DNA的收率。硫酸铵是去除蛋白质、RNA杂质的良好试剂,同时能够保持较高的质粒DNA收率。当质粒提取液中硫酸铵浓度加入到2.5M时,质粒的纯化因子可达到10.2,而收率在90%以上。     

CpG DNA enhances the immune responses elicited by the DNA vaccine against foot-and-mouth disease virus in guinea pigs

CpG DNA is DNA sequence that has immune stimulatory effects. Several lines of investigation over the past few years indicate that CpG DNA plays an important role in the induction of immune responses to DNA vaccines. In this study, CpG DNA-containing synthetic oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) was cloned into the eukaryotic expression plasmid encoding a fusion protein containing b- galactosidase from E. coli and immunogenic epitopes of foot- and-mouth disease virus (FMDV) type O, and the immune responses induced by the plasmid were assayed. The results showed that guinea pigs immunized with the recombinant plasmid containing CpG-ODN generated a higher level of FMDV-neutralizing antibody and a stronger T cell proliferative response and protection against viral challenge than those receiving the plasmid containing no CpG-ODN. Our study demonstrated that it is an effective route to enhance the efficacy of DNA vaccines by inserting exogenous CpG DNA into the plasmids, and the DNA vaccine developed here is a promising candidate to prevent FMDV infection.     

BR316降解2.4—D的基因克隆

本文在对ＢＲ３１６质粒遗传特性研究的基础上，对质粒进行了克隆，经α互补特性观察，重组子ＤＮＡ的酶切分析和重组子在ＤＰ１培养基上的生长情况观测，结果表明重组子具有目的基因降解２．４—Ｄ的特性，并能充分表达和较稳定传代。     

质粒DNA计算模型的计算体系

首先从具体实例入手抽象和归纳出质粒DNA计算模型的概念,并对质粒DNA计算模型计算体系的2个基本要素———计算物质和计算手段进行研究,由此形成了质粒DNA计算模型完备的计算体系;然后针对质粒DNA计算模型计算体系的应用,分析和解决了经常出现的关键问题.讨论了初始质粒DNA重新合成的重要性,并给出了重新合成的方法;接着对计算体系的2个基本实验(酶切和酶连实验)的成功率问题进行了分析,并提出了解决的方案;最后对检测实验进行了分析,提出了检测多种DNA序列的检测方法.对这些问题的分析和解决有利于质粒DNA计算模型理论的完善和应用的拓广.     

水稻基因整合平台系统供体质粒pURKMT的构建

提高水稻产量,改良稻米品质是育种学家广泛研究的课题．随着现代生物技术的发展,水稻已成为植物基因工程的重要研究对象．许多实验室已成功地建立了一系列供外源基因转化水稻的系统．但是这些转化系统主要应用Ｔｉ质粒衍生的载体,通过Ｔ－ＤＮＡ左右两端的序列将目的基...     

聚乙二醇修饰多壁碳纳米管对质粒DNA的影响

利用体外评价方法(plasmid DNAassay)和原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)直接观测相结合,研究原始多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWNTs)、纯化后的MWNTs以及聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰的MWNTs与DNA的相互作用.结果表明:原始MWNTs对质粒的损伤较为严重;纯化后的MWNTs对质粒的损伤有所减弱;而经PEG修饰的MWNTs对质粒的损伤非常小,表现出良好的生物相容性.     

一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法

依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法,结合碱裂解法提取质粒DNA的原理,经过试验摸索,应用了快检缓冲液直接裂解菌液,电泳后筛选重组质粒的方法,避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤,其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致,可快速筛选出重组克隆.     

改进的细菌转化试验方法

本文对“细菌转化实验方法”进行了改进。用改良碱酶法制备的质粒DNA(PBR322)作供体,转化经氯化钙处理的受体菌E.Coli C600,使后者获得抗氨苄青霉素和抗四环素的特性。改进后的转化方法操作简便,不受设备限制。     

碱裂解法提取质粒DNA方法的改进

对碱裂解法提取质粒DNA的方法进行了一些改进 ,在室温下裂解菌体和变性DNA ;用NH4 Ac和LiCl同步沉淀除去样品中的蛋白质和RNA ,降低了对超螺旋质粒的剪切作用 ,得到高质量的质粒DNA。     

含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建

以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG350为出发质粒，插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体pMD-Fib-IE-EGFP，通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中，通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光，表明该质粒能够在真核细胞中表达，为进一步建立完善的家蚕转基因系统平台提供基因材料。     

含有肌球蛋白重链启动子的p-EGFP1质粒的构建

从前列腺组织中提取总DNA，以其为模板经PCR扩增得到肌球蛋白启动子，将扩增片段和处理好的p—EGFP1载体相连，连接产物转入到大肠杆菌HB101中，经筛选得到连有myosin启动子的p—EGFP1重组质粒．用酶切和PCR的方法对重组质粒进行鉴定．成功构建的质粒可用于前列腺平滑肌细胞和成纤维细胞的分离，这将对于阐明前列腺基质增生的机理起到重要作用．