拥挤环境对碱性磷酸酶去折叠过程的影响作用研究

为了更好地模拟细胞内的真实环境，在碱性磷酸酶的变性环境中分别加入小分子渗透剂（蔗糖）和大分子拥挤试剂（葡聚糖），创造拥挤环境，利用酶活力测定和荧光光谱等方法，研究该拥挤环境对碱性磷酸酶稳定性的影响作用．实验结果表明:在碱性磷酸酶由盐酸胍导致的变性过程中，蔗糖与葡聚糖可抑制碱性磷酸酶活力的丧失，随着蔗糖与葡聚糖的质量浓度增加，其抑制效果随之增强；荧光光谱的检测结果也表明蔗糖和葡聚糖对碱性磷酸酶的去折叠具有一定的抑制作用．在2种试剂中，蔗糖对碱性磷酸酶活力与构象稳定性的保护能力要强于葡聚糖．      

新型碱性磷酸酶荧光分子探针合成及光谱性质

合成了以2-(2-羟基苯基)苯并咪唑作为荧光发射团的新型碱性磷酸酶荧光分子探针.苯并咪唑基苯基磷酸二钠盐,利用质谱、红外光谱、核磁共振谱对其结构进行了表征,研究了与碱性磷酸酶反应前后的光谱变化.荧光发射团的激发波长为316 nm ,荧光发射波长为460 nm,激发光与发射光基本不重叠,大大提高了碱性磷酸酶测定的准确性.     

文昌鱼早期发育中两种碱性磷酸酶的表达

以BCIP为底物研究了碱性磷酸酶在文昌鱼胚胎和幼体中的表达图式.在囊胚、原肠胚和神经胚早期(12～13小时)未检测到碱性磷酸酶的特异性表达;到神经胚中期(15小时,约6个体节),碱性磷酸酶在每一体节的中部开始表达,在胚胎中形成3～6个条纹;在18小时神经胚中,碱性磷酸酶在肌节中表达;到24小时在后部内胚层中也开始表达;在36～48小时幼体中,碱性磷酸酶在消化道中强烈表达,但在咽鳃区不表达,同时在肌节中仍有弱的表达.研究表明碱性磷酸酶可能在肌节的发育过程中具有一定作用.碱性磷酸酶在消化道中的表达可能与这一时期消化道开始行使功能有关.为了鉴定文昌鱼碱性磷酸酶的性质,还研究了L-苯丙氨酸对碱性磷酸酶表达图式的影响,结果表明文昌鱼至少存在两种碱性磷酸酶在消化道中表达的一种是肠型的,与脊椎动物碱性磷酸酶可能为同一类型;另一种主要在肌节中表达,可能是组织非特异性的碱性磷酸酶.     

乙醇对鲍鱼碱性磷酸酶活力与构象的影响

以乙醇为效应物研究对鲍鱼碱性磷酸酶(ALP)活力影响的结果表明．酶的剩余活力随着乙醇浓度增大而迅速下降，乙醇浓度40％可使酶活力完全丧失．说明乙醇对鲍鱼ALP有明显的失活作用，JG50为13％．含较低浓度乙醇(30％)的失活过程是可逆的反应．测定乙醇对酶的失活作用机理．结果表明乙醇对鲍鱼ALP的失活作用是非竞争性机制，说明底物存在不影响乙醇对酶的失活作用．应用荧光光谱、紫外吸收光谱研究鲍鱼ALP经乙醇微扰后的分子构象变化，发现乙醇对酶分子构象有显的影响，酶的内源荧光强度随乙醇浓度增大而增强．荧光发射峰逐渐发生红移．紫外吸收光谱在276nm吸收峰随乙醇浓度增大而增强．这些结果表明．酶蛋白分子中的生色基团残基的微环境发生变化．     

杂色鲍碱性磷酸酶在DMSO溶液中的活力与构象变化的研究

以二甲亚砜（DMSO）为效应物．研究其对杂色鲍碱性磷酸酶（ALP）活力的影响，结果表明：该酶的剩余活力随着DMSO浓度增大而迅速下降，当DMSO浓度达40％，酶活力几乎完全丧失．说明DMSO对杂色鲍ALP有明显的失活作用．导致酶活力丧失50％的DMSO浓度为17％．在较低DMSO浓度（〈20％）的失活是可逆的反应过程．动力学研究表明，该酶的失活过程属于混合型．进一步测定游离酶（E）和酶底物络合物（ES）与DMSO的结合常数（K1和K1s），结果表明K1〈K1s即说明底物存在对酶被DMSO的失活作用有一定的保护作用．应用荧光发射光谱研究杂色鲍ALP经DMSO微扰后的分子构象变化情况，随着DMSO浓度增大，荧光强度逐渐增强．但发射峰未发生明显变化现象．说明酶分子中的生色基团残基的微环境发生了一定的变化．     

僧帽牡蛎(Ostreu cucullata)碱性磷酸酶的酶学特性

本文对僧帽牡蛎(Ostrea cucullata)碱性磷酸酶的酶学特性进行了若干探索. 实验结果表明,碱性磷酸酶的最适pH与所用的废物有关,以磷酸苯二钠为底物时,酶的最适pH为10.3,而以β-甘油磷酸钠为底物时,则降为9.5.所得结果证实,pH对酶的影响有可逆和不可逆之分,在pH8.5—10.0范围内,pH对酶的影响是可逆的,而当pH大于10.5时,则为不可逆, 实验求得,僧帽牡蛎碱性磷酸酶对磷酸苯二钠作用的Km值为1.9×10~(-4)M,在10-50℃时.酶对磷酸苯二钠反应的“活化能”为9550卡/克分子。酶在30℃以下活性稳定,最适温度区在39℃附近;50℃保温一段时间,酶活力大大降低. 僧帽特蛎的碱性磷酸酶与从其它材料获得的碱性磷酸酶一样,可被镁离子激活:其最适激活浓度为8.33mM,但被汞离子,锌离子,氰化物和半胱氨酸强烈抑制.氟化物和钼酸盐对酶的影响不明显.     

大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因的克隆表达

大肠杆菌碱性磷酸酶是同二聚体金属酶，被phoA基因编码．采用PCR方法从大肠杆菌K12中扩增到碱性磷酸酶基因（phoA）．用限制性内切酶BamHI和HindⅢ将片段插入克隆载体pETBlue-2．该基因被重组、转化后在大肠杆菌中经IPTG诱导表达，而后进行SDS-PAGE检测及紫外吸收分析测OD410．克隆得到了phoA基因并实现了蛋白表达，碱性磷酸酶的活性提高了18，3倍，为进行组织化学、免疫印迹、突变分析等工作打下了坚实的基础．     

锯缘青蟹碱性磷酸酶活性功能团研究

应用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱及荧光发射光谱的变化研究锯缘青蟹碱性磷酸酶的功能基团性质，结果表明：色氨酸的吲哚基团、赖氨酸的ε－氨基、组氨酸咪唑基及精氨酸残基是酶活性必需基团，而巯基与酶活性无关．     

长毛对虾磷酸酯酶的研究

从长毛对虾(Penaeuspenicillatus)头胸部、肌肉分别提取纯化碱性磷酸酶ALPase(EC．3．1．3．1)和酸性磷酸酶ACPase(EC．3．1．3．2),经快速蛋白液相色谱(FPLC)检测AL-Pase,聚丙烯酰胺凝胶电泳以及等电聚焦电泳检测ACPase,得到单一纯酶．ALPase紫外特征吸收峰在278nm处,荧光激发峰在282nm处,发射光谱特征峰在340nm处．ACPase在280nm处有紫外吸收特征峰,荧光激发峰在284nm处,发射峰在347nm处．分别测定了酶的相对分子质量、亚基数、氨基酸组成、等电点、酶水解对硝基苯磷酸二钠(pNPP)的最适温度,最适pH,米氏常数Km值,金属离子Mg2+、Cu2+、Hg2+,有机溶剂甲醇、乙醇、乙二醇,化学修饰剂BrAe、NBS、pCMB等以及蛋白质变性剂胍、脲等对酶活力的影响．比较研究健康虾和病虾ACPase酶活力及酶动力学特征常数的变化(健康虾酶Km=0．08mmol／L,病虾酶Km=0．143mmol／L)．病虾酶Km值明显增大,表现对底物亲和力下降．活化能明显增大(健康虾酶41．03kJ     

乙醇对大肠杆菌碱性磷酸酶活性与构象的影响

常用有机试剂乙醇作为效应物对大肠杆菌碱性磷酸酶（ＥＡＰ）活性影响状态作用机制进行了研究．结果表明,ＥＡＰ酶活性随着乙醇浓度增大而迅速下降,说明乙醇对 ＥＡＰ有明显的失活作用,ＩＣ５０为１３％．关于乙醇对 ＥＡＰ失活作用机制的研究表明,乙醇对 ＥＡＰ的失活作用是以非竞争性机制模式进行的．应用荧光光谱研究 ＥＡＰ经乙醇微扰后的分子构象变化,发现 ＥＡＰ的内源荧光强度随乙醇浓度增大而增强,说明酶蛋白分子中的荧光发色基团所处微环境已经发生变化,乙醇对 ＥＡＰ分子构象存在显著影响．      

猪肌肉组织中碱性磷酸酶的纯化及特性研究

猪肌肉组织中碱性磷酸酶经预冷的正丁醇提取、硫酸铵分级沉淀、DEAE-52纤维素离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析得到碱性磷酸酶。纯化倍数为57.34,比活力为28.77U/mg。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分析可得该酶的分子质量为66kDa。该酶催化底物对硝基苯磷酸二钠(p-NPP)的最适pH值为9.7,最适温度为30℃,Mg2+和Ca2+对其有激活作用,Zn2+和EDTA对其有抑制作用。     

中国大鲵(Andrias davidianus)二十四种组织器官的碱性磷酸酶(AKP)初步分析

用酶的原位复性电泳方法分析了中国大鲵二十四种组织器官的碱性磷酸酶。结果表明,二十四种组织器官中都有碱性磷酸酶存在,其中230和200 KD的碱性磷酸酶占优势;不同组织器官的碱性磷酸酶活性有差异,心脏中活性最强,眼球中活性最弱;在同一组织中,230和200 KD的碱性磷酸酶活性也有差异。另外,在肾脏和心脏中还含有一种250 KD的碱性磷酸酶,推测与器官的功能有关。     

南方鲶碱性磷酸酶的分子量及氨基酸组成的研究

南方鲶碱性磷酸酶的分子量及氨基酸组成的研究陈定福（西南师范大学生物系）碱性磷酸酶（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＥＣ．３．１．３．１，简称ＡＫＰ）在生物体内的作用和应用功能已有报道￣［１－３］，其他一些学科领域也有ＡＫＰ研究成果，而鱼类ＡＫ...     

酶法水解乳清蛋白过程的优化

以浓缩乳清蛋白为原料，选择碱性蛋白酶（Alcalase）水解乳清蛋白。分析了pH、温度、酶和底物比（E／S）和反应时间等因素对乳清蛋白水解的影响。通过响应面法分析，确定了碱性蛋白酶（Alcalase）酶解乳清蛋白的最佳水解条件为：pH8．5、反应温度55℃、酶和底物比0．05。水解3．0h，水解度为19．34％。     

鸡碱性磷酸酶同工酶研究进展

本文根据近年来国内外关于鸡组织碱性磷酸酶同工酶的研究资料,对鸡碱性磷酸酶同工酶的组织分布、分离、分型、性质、遗传特性及与生产性能的关系进行了比较全面的综述,为更深入地进行碱性磷酸酶同工酶的的研究提供理论指导.     

大肠杆菌碱性磷酸酶突变体的构建及其结构与功能研究

以大肠杆菌碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)高活性突变株(L138PG233S)为亲本,采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变,成功获得了氨基酸替换突变体3个,并对它们的酶活性、特性、内源荧光发射峰等与亲本酶进行了比较分析.结果发现:与亲本酶相比,突变体酶的酶活性降低了18%～85%,Vmax值降低,Km增加,内源荧光发射峰λmax增大等.与亲本酶相同,Zn2 ,Mn2 ,Mg2 仍是它们的激活剂,Na3PO4是它们的抑制剂;这些实验结果说明突变体酶活性的降低直接与其构象变化有关,被替换的氨基酸在维持碱性磷酸酶的结构和功能方面具有特定的作用.     

鸡肝碱性磷酸酶显示方法研究

以鸡肝为材料,利用钙钴法,研究并优化了细胞碱性磷酸酶的显示方法。剪碎鸡肝,低速（500 r/min）离心取得鸡肝细胞悬浮液,制成涂片,在碱性磷酸酶作用液中孵育、染色,在数码互动显微镜下观察鸡肝细胞中碱性磷酸酶的显示与分布。结果表明,在显微镜下能够清楚看到大量黑色沉淀分布,说明细胞中含有大量碱性磷酸酶。     

不带电荷极性氨基酸对兔肝中碱性磷酸酶活性的影响

采用生物化学方法中的有机溶剂分级沉淀法,对碱性磷酸酶进行了分离纯化,用金氏法测定其活性,并用Folin-酚法测定酶含量,然后筛选碱性磷酸酶的最适pH值和最适温度。在此条件下研究不带电荷极性氨基酸对兔肝中碱性磷酸酶活性的影响。结果表明,兔肝中碱性磷酸酶的最适pH值为9.84,最适温度为39℃。在不带电荷极性氨基酸中甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺对碱性磷酸酶的活性有不同的抑制作用,而丝氨酸对碱性磷酸酶的活性有激活作用,这说明不带电荷极性氨基酸对酶活性抑制或激活作用与其侧链基团有关。     

水体及沉积物中碱性磷酸酶的研究进展

阐明了碱性磷酸酶在水体和沉积物生态系统中的作用，重点综述我国海湾和淡水湖泊水体及沉积物中碱性磷酸酶的研究状况。     

3种淡水育珠蚌碱性磷酸酶（ALP）比较酶学的初步研究

分别从三角帆蚌、褶纹冠蚌、背角无齿蚌的外套膜中部分提取了一种碱性磷酸酶，并对这３种来源的ＡＬＰ进行了比活力和动力学性质的比较研究，经过相同提纯步骤后，外套膜ＡＬＰ比活顺序是褶纹冠蚌＞背角无齿蚌＞三角帆蚌；三角帆蚌ＡＬＰ作用于底物磷酸苯二钠的最适ｐＨ值为９．４０，最适温度为３７℃，米氏常数Ｋｍ为０．５３ｍ ｍｏｌ／Ｌ；褶纹冠蚌ＡＬＰ的最适ｐＨ值为９．１２，最适温度为４０℃，米氏常数Ｋｍ为１．７２ｍ