以G-三链体/硫黄素T为探针非标记荧光法检测DNA

为了获得一种简单、灵敏、低成本的DNA检测方法,提出了一种非标记荧光定量检测DNA的方法。信号探针（Signal DNA）和封闭探针（Block DNA）通过部分杂交形成双链DNA结构。所形成的双链DNA结构与靶标DNA作用,释放出一段富G的DNA序列;此富G的DNA序列可形成G-三链体（G-triplex,G3）,可结合硫黄素T(ThT)形成G3/ThT复合物,产生强的荧光信号。通过测定体系中荧光的强度,实现对目标DNA的定量检测,检出限为21 nmol/L。该方法不需要标记荧光染料,成本低,操作简单,灵敏高,在DNA定量检测领域有良好的应用前景。     

基于λ核酸外切酶辅助的级联型铜离子荧光检测体系的构建

通过将一种有效的级联信号放大策略引入铜离子荧光生物传感器中,构建了一种用于超灵敏检测铜离子的荧光检测体系。这种级联型荧光检测体系结合了λ核酸外切酶辅助的靶标回收和催化发夹自组装的循环信号扩增。在铜离子的存在下,用于识别铜离子的功能核酸的底物链被特异性切割和释放。释放出的单链DNA片段(tDNA)与5′端被磷酸标记的双链DNA(TQ-DNA)杂交形成具有平末端的双链DNA。随后,该DNA分子被λ核酸外切酶识别并切割,释放出游离的tDNA和TDNA。随着λ核酸外切酶的水解,越来越多的tDNA被回收,同时放出越来越多的TDNA。此时,TDNA作为催化发夹自组装反应的触发链,启动了新一轮的靶标循环。在TDNA的辅助下,作为分子信标的发夹DNA会与另外一个发夹DNA杂交形成新的双链DNA,同时,释放出高荧光强度。利用荧光光谱法对该体系不同反应阶段进行了表征。结果表明,该级联型铜离子荧光检测体系对痕量铜离子具有很好的响应。     

UDG在两种水生动物病毒核酸片段检测中的抗污染效果研究

尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)作为生物体内的DNA修复酶系,能有效水解单链或双链DNA上的尿嘧啶,可用于PCR过程中残留污染物的清除.本研究以PCR预混液试剂盒作为检测工具,以鲤浮肿病和罗非鱼湖病的阳性核酸片段检测为例,探讨了巢式和荧光定量PCR检测时,UDG的抗污染效果.研究结果表明:(1)向PCR反应体系中添加2...     

通过DNA聚合剪切放大体系提高RNA的检测灵敏度

基于循环的DNA剪切循环放大分子机器构建了一个RNA传感器。该分子机器以RNA为输入,产生大量的DNA片段,并替换报告探针上的荧光DNA从而产生荧光信号,实现对靶RNA浓度的放大检测。本分子机器分为两部分,反应部分和报告部分。在反应部分,以靶RNA为输入条件,以一个特殊设计的探针为反应模板引发一个自发连续的DNA聚合-剪切反应网络,重复产生大量信号DNA链;这些信号DNA链进入报告部分,通过杂交替换反应从一个报告探针上替换下带有荧光DNA序列,释放到溶液中。这样通过剪切产生的大量DNA适体序列被释放到溶液中,并替换报告探针上的荧光DNA,实现信号的放大。     

反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究

目的:建立起简单、快速、灵敏、准确的慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药位点的反向线性探针(reverse line probe,RLP)检测方法.方法:根据HBV野生及耐药基因序列设计通用探针、3'、5'对称加有poly-C的特异性探针和5'标记生物素的扩增引物.将探针线性固定在硝酸纤维膜上,使HBV PCR扩增产物与探针进行杂交.通过优化杂交条件,建立RLP检测方法.利用该方法对重庆地区86个慢性乙肝病人进行检测,同时与直接测序结果比较.结果:半巢式PCR可对103拷贝/ml的血清样本进行有效特异扩增,新建的RLP检测方法可对PCR扩增产物在1 ng/ml以上,或血清样本中突变型DNA占野生型DNA比例为5％以上的均可有效检测,86例临床的检测灵敏度为100％,野生型和耐药型的检测准确性分别为98.09％(103/105)、100％ (43/43),与直接测序法比,RLP检测野生与耐药混合型准确性更好.结论:反向线性探针杂交检测方法检测HBV拉米夫定耐药位点方便、灵敏、准确,是HBV拉米夫定治疗有效的监控工具,该方法适合临床应用.     

基于DNA桥连氧化石墨烯的Fpg荧光检测

甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)可特异性识别并切除由鸟嘌呤损伤产生的8-oxoG碱基以修复DNA序列，因此对Fpg进行定量检测可以反映鸟嘌呤受损程度，为污染物毒性效应评价提供技术手段.基于不同长度的DNA桥连氧化石墨烯(GO)强度不同的原理，以及GO优异的荧光淬灭能力，构建了DNA桥连GO基荧光传感器.该传感器在不同浓度Fpg下，特异性识别和切除8-oxoG碱基，产生短链DNA,其上修饰的荧光基团不能被GO有效淬灭，因而产生荧光信号.该荧光信号与Fpg浓度在一定范围内呈线性关系，可实现Fpg的定量检测，检测的线性范围为0～0.4 U/mL,检出限为0.014 U/mL,并表现出良好的特异性识别能力.采用加标回收法对稀释后胎牛血清中的Fpg进行了检测，回收率为93.5%～111%.其为Fpg快速检测提供了可行的方法，为DNA鸟嘌呤损伤评价提供了一种有效的技术手段.     

磁性富集荧光法检测大肠杆菌

为研究大肠杆菌的高灵敏快速检测方法,建立一种基于萘酰亚胺标记的DNA探针和磁性四氧化三铁氧化石墨烯分离的大肠杆菌O157:H7检测方法。将标记萘酰亚胺的ssDNA(单链DNA)作为捕获探针吸附在磁性氧化石墨烯表面,当目标ssDNA存在时,捕获探针与之部分杂交,利用磁场将目标ssDNA捕获并富集。然后加入释放探针完成杂交,使标记荧光的捕获探针从磁性氧化石墨烯的表面释放出来,通过测定溶液荧光强度可以实现大肠杆菌O157:H7的高灵敏检测。实验结果表明:在一定条件下,O157:H7数量的对数值和荧光强度与空白值荧光强度的比值(F/F_0)呈线性关系,线性范围为150~1.5×10~6个/m L,经过富集后检出限可达100个/m L。该方法灵敏度高,检出限低,耗时较短,操作简单,为致病菌的高灵敏检测提供新思路。     

滚环扩增阳离子共轭聚合物均相检测microRNA

结合恒温滚环扩增(rolling circle amlification,RCA)、单链特异性核酸外切酶Ⅰ(exonucleaseⅠ,ExoⅠ)和阳离子共轭聚合物(Cationic conjugated polymer,CCP)荧光共振能量转移(fluorescence reso-nance energy transfer,FRET)技术,建立了一种特异、灵敏的均相检测microRNA(miRNA)的新方法.该方法应用荧光标记探针与RCA扩增的长链DNA产物杂交,当加入CCP时,其与杂交的标记探针通过静电力结合,发生高效的FRET.未杂交的标记探针利用ExoⅠ水解成单核苷酸,其与CCP相互作用力弱,不能发生有效的FRET.基于此,无需分离和洗涤步骤,实现了RCA扩增miRNA的均相检测.方法特异性好,灵敏度高,线性为0.5～20pmol/L,检出限为0.2pmol/L.方法为miRNA均相检测和原位成像分析以及临床诊断提供了新策略.     

基于金纳米粒子的催化发夹DNA组装检测microRNA

结合金纳米粒子和催化发夹DNA组装,发展了一种检测microRNA(miRNA)的新方法.首先,在金纳米粒子表面修饰荧光素标记的发夹DNA探针P1,P1荧光被金纳米粒子猝灭.当加入目标miRNA分子时,其与P1杂交并形成P1-miRNA中间体,同时打开P1发夹结构.继而P1-miRNA与P2发夹探针结合,形成稳定的P1-P2双链结构,导致P1上的荧光素远离金纳米粒子而释放荧光,同时顶替下miRNA.随后,miRNA又可以引发金纳米粒子表面多个P1与P2探针的组装,如此循环,实现了对miRNA的放大检测.方法中miRNA在50pmol/L~2nmol/L之间呈现良好的线性关系,最低检出限为39pmol/L.方法简便,成本低,应用于HeLa细胞和HepG 2细胞中miRNA的检测,结果满意.     

单链DNA稳定的金纳米簇合成及其检测核酸外切酶Ⅰ活性研究

核酸外切酶Ⅰ在基因组活动和稳定性中起着重要作用,因此,快速检测核酸外切酶Ⅰ的活性对疾病诊断和药物开发具有深远的意义.设计一个高效的DNA模板合成荧光金纳米团簇(Au NCs),以其作为荧光探针,用于简单、灵敏和无标记的方式检测核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)的活性.试验结果表明:随着核酸外切酶Ⅰ的加入,单链DNA将从3'端至5'端被消化,金纳米团簇失去了单链DNA模板的保护出现团聚,导致其荧光强度下降,可用于核酸外切酶Ⅰ活性测定.该方法不需要任何基团的修饰和特殊DNA序列的设计,提高了核酸外切酶I活性测定效率.