精原干细胞体外培养的方法改进

探讨精原干细胞体外培养优化方法,为进一步探讨其生物特征、生殖干细胞移植及生殖损伤及药物保护等研究提供实验基础.制备骨髓基质饲养层,将生后5 d~7 d雄性小鼠生精细胞接种在饲养层上,并于IMDM培养基及37 ℃下共培养,在倒置显微镜下观察细胞生长行为,并对培养后的细胞进行组织学、细胞化学、免疫组化、遗传学鉴定.精原干细胞能在以骨髓基质细胞饲养层上进行增殖和生长,且增殖后的表现出呈簇、团状生长,细胞间可表现出明显的胞质间桥,细胞核大,核/质比高,碱性磷酸酶及C-KIT受体阳性,染色体核型为20对(40条)等精原干细胞的生物学行为特征.原代培养的骨髓基质细胞作饲养层具有取材及制作简便等优点,且能在不添加外源性生长因子的前提下能通过自分泌足够的细胞生长因子,满足精原干细胞体外增殖和抑制分化的需要,是精原干细胞培养的一种良好的饲养层.IMDM培养基、血清及适宜的环境温度是精原干细胞体外培养的重要条件.     

以KnockoutTM SR无血清培养基培养小鼠精原干细胞的研究

设计并应用了KnockoutTM SR无血清培养基,在STO (SIM mouse embryo-derived thioguanine and ouabain resistant)饲养层上培养小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs).结果表明小鼠SSCs在这一体系中能在短期内存活和形成克隆,并缓慢增殖,但不能更长时间地维持干细胞的不分化状态.     

GDNF对睾丸功能的调节

在睾丸中,Sertoli’s细胞等细胞表达胶质细胞源神经营养因子（Glial cell line—derived neuotrophic factor,GDNF）,通过旁分泌或自分泌方式作用于生精细胞和Sertoli’s细胞等,调节精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）的自我更新和分化,并促进Sertoli’s细胞的增殖以及血睾屏障的形成等。     

小鼠精原干细胞的分离、分选、移植和培养

精原干细胞具有自我增殖和分化为精子的能力。精原干细胞的培养、移植和体外诱导分化等研究将使我们最终阐明精原干细胞的自我更新机制和精子发生机理。经过一年多的研究,我们不仅建立了用含血清培养基对分离的乳鼠睾丸细胞进行差异贴壁分选来富集生殖细胞的简单方法,而且成功地对分选出的精原干细胞进行了近一个月的无血清培养。流式分析结果表明,差异贴壁分选能将精原干细胞富集11倍以上。移植分析表明,分选出的精原干细胞具有在受体鼠的曲精小管中产生克隆的能力和正常生精作用。免疫细胞化学和RT-PCR检测表明,培养的细胞表达精原干细胞标志基因。该研究为体外长期培养小鼠或其它哺乳动物的精原干细胞提供了一个范例,也为利用基因修饰的精原干细胞通过移植产生转基因动物奠定了基础。     

原癌基因c-raf在精原干细胞中的表达及作用

本研究用基因测序和BLAST检验扩增的精原干细胞DNA和c-raf的同源性;用MTT法观察c-rafASODNs(反义c-raf寡脱氧核甘酸)拮抗c-raf对体外培养精原干细胞培养的作用,探讨原癌基因c-raf对体外精原干细胞培养增殖的影响.实验结果显示扩增的精原干细胞DNA和c-raf的同源性98%;c-rafASODNs对体外培养的精原干细胞存活呈剂量依赖性抑制作用(P<0.05).提示c-raf在精原干细胞中表达;原癌基因c-raf促进精原干细胞体外培养的增殖.     

昆明白小鼠精原干细胞的体外培养

建立了一种小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的分离、纯化和培养体系,主要包括SSCs的差异贴壁分选(differential adherence selection)、无血清培养基和MEF(mouse embryonic fibro-blast)饲养层。无血清培养基以StemPro-34 SFM为基础培养液,补充多种添加剂和GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor)、可溶性GFRα1(soluble GDNF family receptorα-1)和bFGF(basic fibroblastgrowth factor)等因子。昆明白小鼠(KMmice)幼鼠的生精细胞在这一培养体系中能够培养和增殖1个月。RT-PCR检测还表明培养的细胞同时表达Oct4和Sox2,说明SSCs与ESCs两者的自我复制可能享有共同的维持机制。     

昆明鼠胚胎干细胞的分离培养与鉴定

目的：从昆明系小鼠的早期胚胎分离和培养胚胎干细胞(ES细胞)．方法：收集小鼠3．5d胚龄的囊胚，将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，5—6d后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养，观察集落的生长情况并通过碱性磷酸酶染色、原位杂交、细胞核型分析等对细胞集落进行鉴定．结果：KS细胞集落性生长，符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性．结论：昆明系小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可以发育成ES细胞，并能进行传代培养．     

小鼠胚芽干细胞同种移植治疗慢性肝脏损伤的实验研究

将分离和体外扩增的小鼠胚芽干细胞,用BrdU标记后,经尾静脉同种移植于CCL4制备慢性肝损伤小鼠体内。分别于移植后2w、4w取出肝脏,进行连续冰冻切片,用免疫组织化学和免疫荧光双重染色检测移植细胞在受体小鼠肝内的存活、分布和肝细胞特异性白蛋白的表达;用PAS染色检测移植细胞的糖原代谢;HE染色观察移植动物肝组织的结构变化。探索胚芽干细胞在慢性损伤肝脏中的存活、分化和治疗作用。实验结果表明:胚芽干细胞经静脉移植后可以进入损伤肝脏中,并分化为肝样细胞和肝小叶内的其他细胞,并明显改善损伤肝脏的组织结构,具有较好的治疗作用。     

GDNF对小鼠睾丸支持细胞增殖的影响

探讨胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived fieurotrphie facmr,GDNF)对小鼠睾丸支持细胞(sertoli cell)增殖的影响.对5～10 d的昆明小鼠睾丸Sertoli细胞进行分离培养,利用MTT法检测不同质量浓度GDNF(5,10,20,50μg/L)对Sertoli细胞增殖的影响,流式细胞仪测定DNA含量、分析细胞生长周期的变化.结果表明:5,10μg/LGDNF对Sertoli细胞的增殖有促进作用(p<0.05),20μg/LGDNF对Sertoli细胞增殖有明显促进作用(p<0.01);流式细胞仪检测表明GDNF促进了Sertoli细胞由Go期进入S期和G2期,细胞增殖指数(P1)增加,S期细胞指数(SPF)增加.说明GDNF对体外培养的Sertoli细胞具有促进增殖的作用.     

小鼠精原干细胞的体外培养与鉴定

建立一种简单、有效体外分离和培养精原干细胞（Spermatogonia stem cell,SSCs）的方法。采用酶消化6—8d新生小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液后进行培养,碱性磷酸酶（AKP）染色和间接免疫荧光对培养的细胞进行鉴定;结果显示：SSCs培养3～5天可观察到细胞克隆的产生,AKP染色强阳性;间接免疫荧光显示GCNF阴性,oct-4、c—kit均呈阳性反应。由此可知以DMEM＋15％胎牛血清＋白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）＋L-谷氨酰胺等为培养基,成功建立了精原干细胞的体外培养体系。     

饲养层对维持新建ES细胞系的影响

以ＳＴＯ细胞和鼠胚原代成纤维细胞（ＰＭＥＦ）为饲养层建立了１１个小鼠胚胎干细胞系（ＥＳ细胞系）。两种饲养层细胞都可以维持ＥＳ细胞的正常形态和体外分化能力，但ＳＴＯ细胞不能维持ＥＳ细胞的正常二倍体核型，ＰＭＥＦ的效果经ＳＴＯ为佳，但也仅能短期内维持二倍状态，１０代后染色体数目逐渐发生偏离。分离１０个ＥＳ细胞克隆，讨论了两种饲养层的不同和影响核型发生偏离的若干可能的原因。     

半月国内科技要闻

利用皮肤细胞培育出健康小鼠(图)这只名为"小小"的克隆鼠是中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室周琪和上海交通大学医学院曾凡一等首次利用多功能胚胎干细胞iPS细胞制造的存活并具有繁殖能力的小鼠,在世     

用精原干细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的实验研究

目的　探讨精原干细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的可行性 .方法　构建乙肝病毒X基因表达载体 pcDNA3 X ;应用微量注射针将脂质体包裹的 pcDNA3 X表达载体直接注入C5 7BL/ 6N雄性小鼠睾丸的曲细精管内 ,于第一次注射后 6周 ,与雌鼠交配 ,用PCR法和免疫组化法检测仔鼠基因组中的外源DNA和肝组织中表达的 pX蛋白 .结果　共产仔鼠 16只 ,其中 1只为阳性仔鼠 ,阳性率为 6 .2 5 %.结论　初步明用精原干细胞介导法制备X基因转基因小鼠是可行的 .     

调节造血干细胞的蛋白质

科学家研究发现了一个小鼠蛋白质，它是形成所有的血细胞(包括免疫系统细胞)的干细胞存活所必需的。这些“造血干细胞”的丰富程度不仅仅由干细胞增生所决定，也取决于发育的细胞是否经历程序性的细胞死亡(凋亡)。研究人员表示，蛋白质MCL-1是造血干细胞凋亡的一个关键调节因子。     

CREBBP在小鼠睾丸发育过程中表达模式的研究

睾丸是雄性动物最为重要的生殖器官,主要由曲细精管和间质构成。雄性哺乳动物持续的精子发生依赖于精原干细胞。精原干细胞通过有丝分裂自我更新,并在一些因子的诱导下启动分化进一步发育为精母细胞。研究睾丸中各细胞基因的表达调控对男性不育和睾丸生殖细胞肿瘤的治疗具有十分重要的意义。本研究利用RT-PCR、免疫组织化学及免疫荧光双染的方法主要研究了CREBBP在小鼠睾丸中的表达模式,结果显示CREBBP主要在精原细胞中表达,并在增殖状态的精原细胞中有表达,但在分化后启动了减数分裂的细胞中未检测到阳性信号。因此我们推测CREBBP可能参与了精原细胞的增殖,为后期精原细胞自我更新机制的研究提供理论基础。     

马钱子苷对神经干细胞的增殖、存活和分化的调节作用

为探讨不同浓度的马钱子苷对神经干细胞的增殖、存活和分化的调节作用及其相关分子机制,本实验从成年小鼠大脑中分离培养了神经干细胞,用不同浓度的马钱子苷进行干预,观察马钱子苷对神经干细胞增殖、存活和分化的影响。结果显示：成年小鼠神经干细胞在含有中、高浓度马钱子苷的增殖培养基中培养5 d和7 d后,神经球数量和直径与对照相比显著增加（P<0.05）;中、高剂量的马钱子苷能够促进神经干细胞的有丝分裂,低剂量马钱子苷处理显著促进神经干细胞发生分化（P<0.01）,并增加神经元和星形胶质细胞的数量及比例（P<0.01）;中、高剂量马钱子苷抑制神经干细胞分化（P<0.05）,高剂量的马钱子苷使得神经元的数量减少（P<0.05）。研究结果表明,高浓度的马钱子苷能够促进神经干细胞存活,并通过促进神经干细胞有丝分裂来提高其增殖能力;低浓度的马钱子苷促进神经干细胞分化,有利于神经再生和少突胶质细胞再生。研究结果为神经干细胞治疗中枢神经系统疾病的研究奠定了理论和实验基础。     

人脐带间充质干细胞在肝部分切除模型大鼠体内向肝样细胞的分化

目的:探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)移植到肝部分切除模型大鼠体内能否存活并分化为肝样细胞.方法:用胶原酶消化法从人的脐带分离出MSCs,培养并检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标志.取第5代人脐带MSCs用PKH26标记,制作大鼠肝部分切除模型,将标记的细胞经门静脉植入大鼠体内,观察移植后第1、2、3周细胞能否存活,以及移植细胞能否向肝样细胞分化,表达肝细胞的标记物白蛋白.结果:人脐带MSCs能在体外大量扩增,移植到肝部分切除模型大鼠肝脏后细胞能存活,并表达肝细胞标记物白蛋白,PKH26标记后细胞在荧光显微镜下发红色荧光,荧光显微镜下可见肝脏冰冻切片中散在分布的标记细胞,免疫荧光染色大多数标记细胞白蛋白染色阳性,并发绿色荧光.结论:人脐带间充质干细胞移植至大鼠体内能够存活并分化为肝样细胞,人脐带间充质干细胞可能作为肝细胞移植的重要来源.     

胚胎干细胞的培养体系综述

综述胚胎干细胞培养基，有饲养层培养体系和无饲养层培养体系的主要成分，以及无血清胚胎干细胞培养基。     

小鼠胚胎干细胞R1表面特异结合多肽的筛选

胚胎干细胞是从哺乳动物胚胎发育早期的囊胚的内细胞团内分离出来的一类细胞,具有自我更新和全能性的基本特征.作者利用M13噬菌体展示技术筛选与未分化的小鼠胚胎干细胞R1表面特异结合的多肽.实验利用未分化的小鼠胚胎干细胞为筛选靶细胞,分化的小鼠胚胎干细胞为吸附细胞,进行3轮的消减筛选,经细胞ELISA鉴定,噬菌体DNA测序和多肽序列分析,得到13条能与小鼠胚胎干细胞特异结合的多肽.通过BLASTP比对发现有11个体内的同源蛋白,为进一步研究小鼠胚胎干细胞表面分子提供研究基础.     

原子力显微镜对BALB/c小鼠胚胎干细胞表面形貌的研究

以BALB／c小鼠胚胎干细胞为对象,在大气下用原子力显微镜对其进行成象。由所获得的原子力显微图象可知,BALB／c小鼠胚胎干细胞呈圆形,表面结构致密,细胞大小不一,并且是中间高四周低的形状。