利用人工控制细胞死亡策略培育抗稻瘟病水稻

利用细菌编码RNase的barnase 基因及其特异抑制剂编码基因barstar构成的双元组分系统, 把本实验室构建的具有稻瘟菌(Magnaporthe grisea)诱导活性的嵌合启动子与barnase基因融合, 再与由CaMV 35S启动子驱动的barstar的构件融合, 构建植物表达载体pWBNBS和pPBNBS, 转化水稻, 并对转基因水稻进行了抗稻瘟病和白叶枯病的检测. 结果表明, 接种稻瘟菌后, 转基因水稻植株中barnase基因受诱导表达; 在稻瘟菌侵染诱导下, barnase的表达超过barstar的抑制, 导致转基因水稻叶片出现类似过敏感应, 表现出对稻瘟病的抗性; 转基因水稻对白叶枯病表现出一定的抗性. 这些结果说明, 通过该双元组分系统策略获得的转基因水稻具有明显的抗致病性真菌和一定程度的抗细菌危害的较广谱抗性.     

应用RAPD标记快速鉴定水稻的抗稻瘟病基因

稻瘟病是水稻的一种主要病害.由于稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cuv.)生理小种的多样性和小种致病性的不断变化,使得选育抗谱广、抗性稳定的水稻品种成为一大难题.转育(或选择)含多个抗性基因的品种是解决这一问题的有效途径.然而,不同的抗病基因对某个生理小种的反应可能完全一致,因此,传统的靠接种进行观察选择很难达到选择多个抗性基因的目的.此外,直接进行人工接种,显然受到时间和环境的影响,因而选择的准确性不高.     

利用QTL定位分析水稻的稻瘟病抗性基因

水稻对稻瘟病小种的抗性常表现为多基因的数量性状, 而众多易变稻瘟病小种的存在, 使得水稻的抗性研究进展缓慢. 为了探讨抗性基因座的分布及相互作用, 选择20个稻瘟病生理小种, 接种源于ZYQ8/JX17的双单倍体分离群体, 利用Cartographer QTL作图软件, 鉴定出124个抗性QTL, 分别位于12条染色体72个标记区间100个位置上. 其中小种HB97-36-1鉴定出16个QTL, 1个小种未鉴定出任何抗性基因座, QTL对表型变异的贡献率介于3.52%~68.64%之间. 有82个QTL (66.13%) 的抗病等位基因源于抗病亲本ZYQ8, 42个QTL(33.87%) 的抗病等位基因源于感病亲本JX17. 多数鉴定的抗性QTL分布于已定位的主效基因附近, 其中位于第1, 2, 8, 10和12染色体上的基因座较为集中, 分布呈簇状. 比较基因座的位置发现, 1个抗性基因座可以对几个不同的生理小种表现抗性, 但抗性的效率不同.     

粳稻云引稻瘟病抗性近等基因系与免疫应答相关的LRR-RLKs差异基因分析

在广谱抗稻瘟病品种云引与普感稻瘟病品种丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu, LTH)构建的近等基因系抗、感病子代基因组重测序的差异基因中,从与免疫应答(immune response)相关的分类单元里得到8个基因序列有差异的基因.它们都为编码富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶基因,并聚集于11号染色体的邻近位置,且与已知的白叶枯病抗性基因Xa21具有一定同源性.为进一步探究这些类受体蛋白激酶类基因在稻瘟病抗性中可能发挥的功能,我们分析了这些基因的结构、进化及抗感子代间的序列差异类型,同时还分别采用离体和喷雾接菌的方式对云引和LTH进行稻瘟病接种并取样.通过实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)发现,部分基因能受到稻瘟病菌的诱导,推测它们可能在水稻对抗稻瘟病病菌中发挥一定作用,为进一步挖掘稻瘟病相关抗性基因奠定基础.     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

水稻“抗癌”新因子bsr-d1

稻瘟病被称为水稻"癌症",严重危害水稻的产量和品质,应用广谱持久抗稻瘟病基因是抵御稻瘟病侵害最有效的方法之一。利用全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)结合重组自交系遗传群体共相关分析,从广谱持久高抗稻瘟病水稻材料"地谷"中鉴定并获得了一个广谱抗病遗传位点bsr-d1。bsr-d1通过调控过氧化氢酶基因的表达调节H_2O_2的积累,从而影响水稻的稻瘟病抗性。bsr-d1提高稻瘟病抗性的同时,对水稻产量和品质影响不明显,因此在水稻抗病育种中具有广阔的应用前景。     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

高等真核细胞受极低频磁场作用后特异反应基因的克隆及鉴定

极低频磁场（ＥＬＦ ＭＦ）生物学效应的机理研究是当前生物电磁学中迫切需要解决的问题．为探索 ＥＬＦ ＭＦ的特异反应基因及这些基因的结构与功能,用 ｍＲＮＡ差异显示技术（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ, ＤＤ）对受ＥＬＦ ＭＦ辐照与假辐照的Ｄａｕｄｉ细胞内的ｍＲＮＡ进行了检测,筛选到一个受ＥＬＦ ＭＦ诱导表达的ＤＤ片段（＞１ｋｂ）,反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ鉴定进一步证实系磁场诱导所致．经克隆测序及与ＧｅｎｅＢａｎｋ同源性比较表明该基因片段（ＭＦ－ＣＡ）是人细胞中新发现的受磁场诱导的反应基因。     

一个水稻P450 CYP72A基因簇受病原菌诱导和发育及组织特异性表达

细胞色素P450超基因家族广泛参与植物的各类生命活动,包括植物对病原菌的防卫反应.我们在植物病原菌诱导基因的DD-PCR分析时,分离到一个受病原菌侵染诱导的水稻cDNA片段.水稻基因组公布后,发现该片段位于1个包含7个P450 CYP72A基因(CYP72A17～23)的基因簇的保守部分.以此片段搜索水稻数据库发现,水稻CYP72A家族有14个成员,这14个蛋白质之间的差异主要在N端,C端则同源性很高.我们分别对该基因簇的7个成员进行了表达特性分析,发现其中CYP72A18,19,22和23的表达受稻瘟病菌侵染的调节,而且在抗、感植株中的表达存在明显差异.除CYP72A20外,其余6个CYP72A基因均具有发育和组织特异性表达的特征.CYP72A20在所有研究中均检测不到信号,可能为一个假基因.这些发现为水稻P450基因功能的研究提供了新的资料.     

水分胁迫诱导表达的小麦基因的cDNA片段克隆和序列分析

以30％（-1.13 MPa）PEG-6000对小麦幼苗进行重度水分胁迫处理,利用mRNA差异显示技术分离了水分胁迫诱导表达的小麦基因dil（dehydration induced,dil）的cDNA片段。Northern blot分析表明,dil基因在水分胁迫10h后表达开始增强并随着水分胁迫时间的延长而增强,水分胁迫48h时其表达最强。对dil基因的cDNA片段进行了克隆和序列测定（211bp）。经查询,在GenBank中没有与dil同源的基因序列。     

稻瘟病菌坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的原核表达、纯化与活性分析

坏死和乙烯诱导肽1(necrosis and ethylene-inducing peptide 1, Nep1)样蛋白(Nep1-like proteins, NLPs)是一类广泛存在于细菌、真菌及卵菌中的分泌型蛋白.本研究通过生物信息学分析了稻瘟病菌中的4个坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的家族基因成员的相关信息,克隆了它们的编码区序列,分别将它们构建到了pGEX-6P-1载体中.通过优化诱导条件对它们进行了原核表达、纯化,获得了相应的可溶性目的蛋白,进一步将纯化的目的蛋白注射到烟草叶片中,发现N端融合GST标签的MoNLP1、MoNLP4蛋白仍具有生物学活性,可以明显诱发烟草叶片组织产生细胞坏死.该研究为进一步深入研究该基因家族在稻瘟病菌中的功能与作用以及开发更多潜在的植物蛋白激发子奠定基础.     

利用土壤农杆菌将天花粉蛋白基因转入水稻植株并检测抗稻瘟病活性

通过土壤农杆菌方法将天花粉蛋白基因转化到水稻中, 获得了具有单拷贝外源基因插入和表达的水稻再生植株. 抗稻瘟病(Pyricularia oryzae)检测发现, 接病菌后1个月内转天花粉蛋白基因植株在发病时间、发病植株数、发病叶片、发病后的植株生长状况等各项指标上与对照的转GUS基因植株比较均有较大差异. 在去除高湿度的发病环境后, 转天花粉蛋白基因植株的生长情况也明显优于对照植株. 表明转基因水稻对稻瘟病侵害至少有明显的延迟发病抗性. 天花粉蛋白基因在水稻中的表达未发现对宿主植物生长有明显影响.     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因.利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合,构建了含4892个单株的F2定位群体.同时,利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库,构建了一个覆盖目标基因位点的长约213kb的跨叠克隆群.根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列,以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序,设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位.xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离,标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM,物理距离约为24 kb.对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测,揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因.对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

人肝组织中新的C_2H_2型锌指蛋白编码序列的批量分离与克隆

为了探讨人肝组织中C2 H2 型锌指蛋白基因的分布数目以及克隆新的锌指蛋白基因 ,设计了简并PCR引物 ,扩增基因组DNA ,以其中的 2个扩增片段为探针筛选人肝cDNA文库 ,获得了近百个阳性克隆 .对其中的 2 0个cDNA片段进行了末端测序和同源检索 ,证明 1 5个为新的锌指基因片段 .对其中的 4个cDNA片段进行了组织表达谱分析 ,Northern杂交显示 :L5 5为肝、胰脏高度表达 ;其余为广谱表达 .利用FISH将其中的 2个片段L2_9和L5_5分别定位于 1 9q1 3.3和 1 8q1 2 .1 .     

水稻抗稻瘟病及高氨基酸突变体离体筛选的初步研究

近年来,国内外利用细胞诱变离体筛选生物技术,已经先后获得烟草、马铃薯、番茄、玉米、水稻、油菜、大豆、甘蔗、小麦、胡萝卜、苜蓿和小黑麦等作物抗性突变体以及水稻、玉米、烟草高氨基酸突变体。但有关后代抗性遗传的研究报告并不多见。最近,我国上海市农科院郑祖玲等指出,稻瘟病菌粗毒素提取液对粳稻花药培养具有抑制效应,可作为培养基的外源添加物筛选抗病突变体.在近年来研究的基础上,简要报道利用水稻体细胞和花粉性细胞无性系离体筛选以及花药培养抗性筛选,获得15个抗稻瘟病和9个高氨基酸突变体的研究结果。     

致病性念珠菌DNA的AFLP指纹图谱

半知菌亚门中的念株菌(Candida)约有20个种是人体呼吸道,胃肠道,皮肤及生殖器官的常见腐生菌,它们还是AIDS患者念株菌性鹅口疮、食道炎及侵袭性感染常见的原因.通常的血清学鉴定方法是以不同菌体表面多糖抗原物质的差异为依据,但由于念珠菌有些菌体间抗原物质很相似,相互间有交叉反应,因此很难反映出实际的感染情况;而传统的表型分型法除了受环境因素和真菌本身变异的影响外,还受到实验本身重复性差,操作过程繁琐以及实验结果的判断有时并不十分明确等诸多因素的干扰.因此,建立一种稳定、快速、准确的致病性念珠菌基因分型鉴定方法在临床上对指导诊断和治疗具有重要的意义.由Zabeau等人1992年创立的AFLP(Amplified fragment length polymorphism)技术是目前国际上构建DNA指纹图谱的最新方法之一,该方法结合了RFLP(Restriction frag-ment length polymorphism)技术和RAPD(Random amplified polymorphic DNA)技术的特点,使用人工接头(Adapter)与限制性内切酶酶切的基因组DNA片段连接并以此为DNA模板,合成系列3’-末端随机变化数个碱基且与人工接头序列相互补的PCR引物进行PCR特异条件扩增,经电泳检测后可获得DNA指纹图谱.本研究针对临床上常见的8种致病性念珠菌,以Pst I酶切基因组DNA构建了致病性念株     

13个水稻WRKY基因的克隆及其表达谱分析

转录调控因子WRKY蛋白拥有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和Cys₂His₂或Cys₂HisCys锌指型结构. 利用WRKY蛋白质的保守结构域, 搜索了整个水稻基因组编码WRKY蛋白质的基因, 鉴定了97个WRKY基因, 并从4℃胁迫的水稻植株cDNA文库中获得13个WRKY基因全长cDNA克隆. Northern blotting分析结果显示, 其中10个WRKY基因的表达受到NaCl, PEG, 低温(4℃)和高温(42℃)等4种非生物逆境因子胁迫的影响, 但其诱导表达模式不论在逆境因子种类还是在诱导时间上均存在着很大的差异, 这种基因诱导表达模式的差异可能体现于它们之间的生物学功能的差异.     

稻瘟病病原物诱导启动子的构建及表达

利用ＰＣＲ技术从小麦和马铃薯中分别扩增并克隆了病原诱导性谷胱甘肽－Ｓ－转移酶基因ＧｓｔＡｌ和Ｇｓｔｌ启动子片段,将它们分别与水稻肌动蛋白基因（Ａｃｔｌ）核心启动子序列、５’端非翻译前导序列以及ＧＵＳ基因融合构建出植物载体ｐＷＭＩＧ－５０和ｐＰＭＩＧ－５０,然后转化水稻,并对嵌合启动子的诱导活性进行了分析。结果表明：（１）在转基因水稻细胞中嵌合启动子可受稻瘟病病原物的诱导;（２）水稻Ａｃｔｌ第一内含     

一个水稻P450 CYP72A基因簇受病原菌诱导和发育及组织特异性表达

细胞色素P450超基因家族广泛参与植物的各类生命活动, 包括植物对病原菌的防卫反应. 我们在植物病原菌诱导基因的DD-PCR分析时, 分离到一个受病原菌侵染诱导的水稻cDNA片段. 水稻基因组公布后, 发现该片段位于1个包含7个P450 CYP72A基因(CYP72A17~23)的基因簇的保守部分. 以此片段搜索水稻数据库发现, 水稻CYP72A家族有14个成员, 这14个蛋白质之间的差异主要在N端, C端则同源性很高. 我们分别对该基因簇的7个成员进行了表达特性分析, 发现其中CYP72A18, 19, 22和23的表达受稻瘟病菌侵染的调节, 而且在抗、感植株中的表达存在明显差异. 除CYP72A20外, 其余6个CYP72A基因均具有发育和组织特异性表达的特征. CYP72A20在所有研究中均检测不到信号, 可能为一个假基因. 这些发现为水稻P450基因功能的研究提供了新的资料.     

T-DNA插入稻瘟病菌Gγ亚基基因启动子的突变体A1-412丧失形成附着胞、穿透和致病能力

用TAIL-PCR的方法获得了A1-412突变体的T-DNA侧翼基因组序列, 测序结果表明, 外源T-DNA插入到稻瘟病菌G蛋白γ亚基基因MGG1 (Magnaporthe grisea G protein Gamma亚基)的启动子区域. MGG1编码93个氨基酸, 具有典型的G蛋白γ亚基结构域(GGL)和C末端CAAX框, 并与其他丝状真菌G蛋白γ亚基有较高的一致性. 外加cAMP能诱导部分A1-412分生孢子形成附着胞, 但这些附着胞的形态不正常, 不能穿透洋葱内表皮或水稻叶片. 另外, A1-412与相对应交配型的菌株杂交时几乎不产生子囊壳. 将MGG1基因重新导入A1-412突变体可部分恢复上述表型. 这些结果表明, G蛋白γ亚基MGG1可能涉及稻瘟病菌形态分化、有性生殖、致病性等方面的调节作用.