SLP-2基因在乳腺癌细胞系中的表达及对MCF-7细胞增殖的影响

人的SLP-2基因在乳腺癌组织的高表达与病人的存活率相关.为了研究SLP-2在乳腺癌中的功能,应用免疫印记的方法检测SLP-2在不同乳腺癌细胞中的蛋白表达水平,发现随着细胞癌化程度的增强其表达也增强.成功构建p CMV-Myc-SLP-2重组质粒,证明了其在MCF-7细胞的表达,MTT实验结果表明SiRNA转染乳腺癌细胞MCF-7可以抑制细胞增殖,同时发现SLP-2在乳腺癌细胞系中表达量与HER2/nue呈负相关.这些结果为深入研究乳腺癌的发生和发展奠定了基础.     

建立可诱导表达TNFAIP1的稳定细胞系

利用Tet-Off可诱导表达系统在HT1080细胞中建立可诱导表达TNFAIP1基因的稳定细胞系.首先将融合表达GFP的TNFAIP1片段克隆到反应质粒pTRE2hyg中,然后将该质粒转染到HT1080/Tet-off细胞中,使用潮霉素B筛选,挑取单克隆,得到稳定转染的细胞系,扩大培养后在荧光显微镜下观察克隆的诱导效率,得到了低背景,高效诱导表达GFP-TNFAIP1的稳定细胞系,便于研究TNFAIP1在细胞生长、细胞周期和细胞信号通路等方面的作用.     

HIV-1型Nef基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

为了构建艾滋病毒HIV-1型Nef基因重组表达载体,利用PCR从p NL4-3质粒上扩增HIV-1型Nef基因,获得Nef基因完整的编码区,构建可表达Nef蛋白的p EB-myc-nef重组表达载体.经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染SW480细胞,通过Western Blot技术检测Nef蛋白的瞬时表达.为了建立稳定表达Nef基因的SW480细胞系,采用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法,筛选出单克隆细胞系.扩大培养克隆细胞后,通过RT-PCR和Western Blot分别检测Nef的mRNA转录水平及蛋白表达水平,经长达60 d的传代,最终获得稳定表达Nef基因的SW480细胞系,为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.     

长链非编码RNA SLC7A11-AS1对顺铂耐药人肺癌细胞耐药性的影响

在人肺癌H460及H460/DDP细胞中,通过干扰长链非编码RNA SLC7A11-AS1来探究其对细胞耐药的影响.通过大数据库分析SLC7A11-AS1与肺癌患者生存期的关系,利用实时定量PCR检测SLC7A11-AS1在人肺癌细胞H460和顺铂耐药细胞株H460/DDP中的表达.在H460/DDP细胞中瞬时转染SLC7A11-AS1的干扰片段,MTT法检测H460/DDP对顺铂药物敏感性的变化.结果表明,SLC7A11-AS1表达量高的肺癌患者生存期明显短于SLC7A11-AS1表达量低的肺癌患者(P＜0.05);SLC7A11-AS1的表达在H460/DDP细胞中明显上调(P＜0.05);干扰SLC7A11-AS1表达后,H460/DDP细胞对顺铂的化疗敏感性明显提高.因此,SLC7A11-AS1与肺癌的不良预后相关并影响肺癌的化疗耐药.     

非受体酪氨酸激酶BMX对宫颈癌C-33 A细胞成球能力的影响

为探索非受体酪氨酸激酶BMX(也称Etk)对宫颈癌C-33 A细胞成球能力的影响,应用免疫细胞化学和Western blot检测BMX在宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、C-33 A、HT-3、CaSki中的表达及定位,构建BMX过表达质粒载体,转染至C-33 A细胞中,筛选稳定过表达的细胞株,利用细胞成球实验检测BMX对C-33 A细胞成球能力的影响。免疫细胞化学染色显示,BMX主要在细胞浆中表达,在细胞核中也有部分表达,在HeLa、SiHa、HT-3及CaSki细胞系中BMX高表达,而在C-33A细胞中低表达。Western blot检测也得出同样的结果。将BMX过表达质粒载体转染至C-33A细胞系中,鉴定稳定过表达的细胞株(C-33 A-AcGFP,C-33 A-BMX)。对照组和BMX过表达组细胞成球实验显示,对照组球体较为松散而过表达组较为密实,两组细胞成球率无明显差异(P0.05),但是过表达组球体直径明显大于对照组(P0.001)。上述结果表明:非受体酪氨酸激酶BMX促进宫颈癌C-33 A细胞的成球能力。     

复方苦参联合5-氟尿嘧啶调控细胞周期蛋白D1抑制乳腺癌生长作用的研究

为了解苦参联合5-氟尿嘧啶(5-Fu)对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡及对Cyclin D1表达的影响,采用流式细胞术观察联合用药组(复方苦参+5-Fu)和对照组(二甲基亚砜DMSO+5-Fu)处理后MCF-7细胞凋亡的情况;采用免疫印迹法(Western Blot)观察两组MCF-7细胞Cyclin D1的表达;采用CCK-8细胞增殖实验观察两组MCF-7细胞增殖情况;采用RT-PCR观察两组MCF-7细胞中Cyclin D1 mRNA的表达;建立裸鼠荷瘤模型,并观察两组肿瘤组织中Cyclin D1的表达.结果联合用药组处理的MCF-7细胞凋亡(12.7%)高于对照组(6.2%),差异显著.联合用药组MCF-7细胞中Cyclin D1 mRNA及Cyclin D1的蛋白表达均低于对照组;联合用药组MCF-7细胞的增殖能力低于对照组(P0.05);裸鼠荷瘤后,联合用药组的直径为(79.8±10.3)mm,明显小于对照组的直径(176.7±26.2)mm(P0.05).说明苦参可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞中Cyclin D1的表达,并抑制MCF-7细胞的增殖,加速MCF-7细胞的凋亡,其机制可能与抑制Cyclin D1的表达有关.     

中心体蛋白centrin2稳定高表达慢性髓原白血病细胞系的构建及鉴定

将质粒转染慢性髓原白血病细胞K562,经过G418筛选获得稳定高表达centrin2的细胞株.通过免疫荧光显微镜观察细胞的变化,使用蛋白免疫印迹方法鉴定细胞株内centrin2蛋白的过表达效果,并通过细胞免疫荧光染色技术方法观察中心体上centrin2含量的改变.成功获得了一株稳定高表达centrin2的K562细胞株(K562-GFP-centrin2)和稳定表达无意义GFP的对照细胞(K562-GFP).成功构建了稳定高表达centrin2蛋白的慢性髓原白血病细胞K562-GFP-centrin2,为细胞中心体成功的提取奠定基础.     

猪传染性胃肠炎病毒sM基因反义逆转录病毒的包装和鉴定

将编码猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)sM基因的cDNA反向插入逆转录病毒表达载体pLXSN中,质脂体法将重组质粒plxas-sM转染PA317细胞,经抗生素G418(500μg/mL)筛选出稳定的产毒细胞克隆.分别扩大培养细胞克隆,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的重组病毒滴度,最高达1.50×105CFU/mL.提取重组病毒的RNA进行RT-PCR分析,结果表明成功获得plxas-sM逆转录病毒.     

CircFndc3b对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响及机制预测

为探讨CircFndc3b对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响,并预测其调控机制,利用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测CircFndc3b在不同乳腺癌细胞系中的表达;siRNA敲低CircFndc3b表达后,利用Transwell检测MCF-7和MDA-MB-231细胞侵袭能力变化,利用划痕实验检测MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移能力变化,利用蛋白免疫印迹(Western blotting)检测侵袭迁移相关蛋白的表达变化;miRDB数据库预测CircFndc3b潜在靶点并通过qRT-PCR验证miRNA-5702和miRNA-7106-5p在乳腺癌中的表达水平。结果表明:CircFndc3b在人乳腺癌细胞中表达水平显著高于人正常乳腺上皮细胞(均P0.01);敲低CircFndc3b表达后,侵袭的MCF-7和MDA-MB-231细胞显著降低(均P0.01),同时MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞的迁移距离显著降低(均P0.01);Western blotting检测显示敲低CircFndc3b表达导致MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中E-cadherin表达明显升高,而N-cadherin表达显著降低(均P0.01)。CircFndc3b具有47个潜在的靶点miRNAs,敲低CircFndc3b后,miRNA-5702和miRNA-7106-5p表达水平在MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中显著升高(均P0.01)。综上所述,CircFndc3b促进了乳腺癌细胞侵袭和迁移,其作用可能与调控miRNAs表达有关。     

人源抗菌肽LL-37在烟草中的表达

为探讨用植物生物反应器生产LL-37的可行性,利用DNA重组技术将LL-37与植物病程相关蛋白信号肽基因融合,经测序证实序列和阅读框正确后,连接到质粒pBin438上,构建含LL-37 cDNA植物分泌型表达载体pBin/LL-37.通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacience)介叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum.NC-89).用PCR和Western blot对转化植株进行分子鉴定.80%转基因植株表达重组LL-37多肽.T0代转基因烟草的蛋白粗提物有抑制Staphylococcus aureus和Escherichia coli生长的活性.LL-37基因在转基因烟草中成功表达,提示用植物表达系统生产活性LL-37蛋白是可行的.     

Src真核表达载体的构建与表达

构建酪氨酸蛋白激酶Src真核表达载体,并检测其在HEK293T细胞中的表达.根据Genebank（GI：4574718）提供的大鼠Src的cDNA序列设计特异性引物,以大鼠海马总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Src的目的基因,然后克隆至真核表达载体pcDNA3.1.将筛选的阳性重组子转染入HEK293T细胞系,免疫印迹检测Src的蛋白表达水平,经限制性内切酶双酶切及测序分析,扩增的Src的cDNA成功连接入pcDNA3.1,并且序列与Genebank中一致.免疫印迹结果表明,构建的Src-pcDNA3.1可在HEK293T细胞中表达.成功构建了Src-pcDNA3.1真核表达载体,并且可在HEK293T细胞中高效表达.     

人类基因ZNF569结构域在MAPK信号途径中的作用

有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径是细胞信号转导过程的重要组成部分，MAPK将膜转导蛋白与其细胞内的关键调控靶蛋白联系起来，从而介导胞外的多种信号并将这些信号级联放大后传递给相应的下游因子，通过激活包括SRE，ELK-1，AP-1等在内的多种转录因子，最终开启细胞特定功能基因的表达，锌指蛋白是人类最大的基因家族之一，其蛋白产物主要通过与DNA相互作用而起转录因子作用，调节靶基因的表达以适应生物体发育、分化、成熟过程的需要，运用MAPK信号途径对锌指基因ZNF569的结构域进行了转录活性分析，分析表明在COS-7细胞中过表达ZNF569蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子AP-1和SRE的转录抑制活性显著下降，ZNF569在核质内的亚细胞定位分析进一步证明了其作为转录因子的作用，对ZNF569的分段report assays分析表明，ZNF569可能通过KRAB框和C2H2锌指结构域行使其抑制转录的作用，这些结果表明，ZNF569可以通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程。     

甜菜M14品系Cystatin基因植物蛋白纯化表达载体的构建及转化烟草

植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一类具有提高植物对各种生物及非生物胁迫抗逆性的重要蛋白质。利用前期获得的甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的编码区序列构建了带有His标签的甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的植物蛋白纯化表达载体,并将其转化烟草,获得T0代阳性转基因植株,为下一步利用融合蛋白的His标签从转基因烟草中大量纯化甜菜M14品系半胱氨酸蛋白酶抑制剂奠定了基础。     

海洛因对小脑皮质C-FOS表达的影响

为探索海洛因对小脑皮质C-FOS表达的影响,通过肌肉注射海洛因建立成瘾大鼠模型,用免疫组化方法检测小脑细胞C-FOS的表达.结果表明,大鼠连续注射7 d后,出现明显的戒断症状;小脑细胞中C-FOS表达阳性细胞数比对照组明显增多,与对照组相比有显著性差异（P〈0.01）.证明海洛因具有诱导C-FOS基因表达、损伤脑组织细胞的作用.     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)J1C7毒株。用纯化的病毒颗粒提取RNA基因组。根据已报道的IBDV JD1株的VP2序列设计引物,利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)进行扩增,将获得的1 359 bp片段克隆于pMD 18-T载体上。经过限制性酶切及PCR鉴定后,得到阳性重组质粒。对VP2基因进行全序列测定表明,克隆的VP2基因长1 359 bp,编码452个氨基酸。J1C7株VP2蛋白高变区内两个亲水区与其他标准Ⅰ型毒株完全相同,而且具有弱毒疫苗株的特征性氨基酸:222P、256V、279N、284T、294L、299N,七肽区的氨基酸序列为SWS ARGS,因此,从分子水平上推断本研究的J1C7株为标准Ⅰ型毒株,且属于弱毒疫苗株。与已报道的IBDV VP2基因的氨基酸序列进行比对,结果表明,本研究的J1C7株与来自欧洲和中国的弱毒疫苗株有密切的亲缘关系。     

ChsA启动子驱动的IPT基因植物表达载体的构建

为研究异戊烯腺苷类细胞分裂素与花衰老进程的相关性,本研究通过PCR方法从矮牵牛中克隆到花瓣特异性表达的矮牵牛查尔酮合成酶基因A（ChsA）的启动子PchsA,并以其取代植物表达载体pBI121中的组成型启动子CaMV35S,然后将IPT基因插入到PchsA启动子下游,测序结果显示花瓣特异性启动子驱动的IPT植物表达载体构建成功.     

利用接头插入技术构建环型T载体(pYCQ1)

人工设计接头序列,其特点为含有3′突出A末端,同时人工接头序列内部含有XcmⅠ、BspM901、AceⅡ酶切位点。利用人工接头3′突出A与线性的pMD18-T载体的3′突出T连接,将线性的pMD18-T载体改造成环形具有自身复制功能的pYCQ1载体,降低了实验室使用T载体的成本,同时增加了载体的克隆位点。利用pYCQ1作为T载体时,用XcmⅠ酶切(XcmⅠ限制性片段具有3′T末端)pYCQ1载体可以得到线性的3′T粘性末端的pYCQ1-T载体。实验验证,pYCQ1-T载体可以在受体菌E.coliDH5α中进行大量自我复制,并能够克隆1 800 bp的外源PCR产物。     

郁金香ACC氧化酶基因RNAi表达载体的构建

为了构建郁金香ACC氧化酶基因的RNAi表达载体.采用Trizol法提取了郁金香花瓣总RNA,根据郁金香ACC氧化酶基因编码区序列,设计了带有限制性内切酶位点的特异性引物,成功地扩增得到了郁金香ACO基因保守片段.将此片段以正向和反向插入到中间载体pBSin内含子的两端,构建成发卡结构的RNA片段,利用pCAMBIA35S-1301作为桥梁载体,构建了带发卡结构的RNAi表达载体pCAMBIA-ACO.     

导入额外拷贝dctA基因的根瘤菌工程菌株的构建

为进一步提高大豆根瘤菌的固氮能力,以费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067基因组的DNA作为模板,采用PCR扩增技术,克隆四碳二羧酸转移酶结构基因dctA的全长序列;将其连入lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的pTR-Plac-dctA重组表达载体。利用三亲本杂交技术将表达载体转入费氏中华根瘤菌中,构建大豆根瘤菌工程菌株。研究表明,转基因工程菌株侵染大豆幼苗后与出发菌相比,固氮酶活性有了显著提高,为提高大豆产量的研究提供一定参考。