绿色荧光蛋白在分子细胞生物学研究中的应用

绿我荧光蛋白具有优良的特性,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何外源底物或内源辅助因子的参入就能发出绿色荧光,绿色荧光蛋白基因的表达可用来监控活细胞或生物体中基因表达和蛋白质的定位,这是一个革命性的进展,而且,对基因ＤＮＡ序列的改造可能使绿色荧光蛋白的发光特性更加优良,从而共应用范围会更加广泛。     

使用差异定位SunTag组件实现对细胞质内高含量蛋白的活细胞观察

生物过程由数百万个蛋白质驱动.蛋白质结构和蛋白质定位是蛋白质行使功能的关键.在过去的研究中,快速发展的荧光显微镜成像技术使研究人员可以直接观察蛋白质在活细胞内的定位.然而,对细胞质内高含量蛋白的活细胞观察仍然存在技术障碍.我们通过改进SunTag标记技术,使用差异定位的SunTag组件:一方面,在研究目的蛋白(POI)上标记多个V4抗原;另一方面,将识别V4抗原的抗体GCN4融合的绿色荧光蛋白(GCN4-GFP)通过差异定位后限制其与抗原的结合量.我们的方法大大降低了背景荧光信号,实现了对dynamin膜上功能单位的直接可视化.     

绿色荧光蛋白基因mgfp4在水稻愈伤组织中的瞬时表达

采用基因枪方法将适用于高等植物的绿色荧光蛋白基因ｍｇｆｐ４转化到水稻愈伤组织之中,获得高效瞬时表达,在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察到强烈绿色荧光。绿色荧光蛋白ｍＧＦＰ４生色团形成迅速,转化４ｈ后就能观察到绿色荧光,并且持续时间较长,２ｄ后才基本消退。     

金堂黑山羊FSH受体基因在酿酒酵母细胞中的表达与定位

通过激光共聚焦显微镜对卵泡刺激素受体（FSHR）FSHRA和FSHRB与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白的表达和定位进行观察,发现FSHRA和FSHRB不仅在酿酒酵母细胞中有表达,而且表达的蛋白质主要定位在酵母的细胞膜上.     

通过pR1aS导肽提高植物中绿色荧光蛋白的激发强度

绿色荧光蛋白在植物细胞胞质表达中对转化植物细胞的再生存在不利的影响,为增强绿色荧光蛋白在植物细胞中的表达,在mgfp的5'端连接了pR1aS信号肽序列,同时在3'末端引入滞留在内质网中的特异序列KDEL,成功构建了植物表达载体pBLG-pR1aS-gfp,经转基因烟草表达分析,结果表明:转化体植株显著增加了绿色荧光蛋白在烟草中的表达,同时消除了绿色荧光蛋白对植物潜在的光毒害。这为植物转基因转化频率的研究和转基因植物安全性评价提供了一种有利的工具。     

绿色荧光蛋白基因在大黄鱼体内的表达

以绿色荧光蛋白基因为报告基因，以pIRESnco为载体质粒，制备含有报告基因的质粒，以肌肉注射的方式导入大黄鱼体内，每隔一周用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因在鱼体不同部位的表达情况。结果表明，绿色荧光蛋白基因可以大黄鱼体内得到表达，表达时间高达28d以上。绿色荧光蛋白基因不仅可以在肌肉注射部都组织细胞得到表达，而且在其它部位的肌肉、肝脏、肾脏和心脏等组织中也有表达，但表达水平低于肌肉注射部位组织。     

绿色荧光蛋白在肿瘤活体光学成像中的应用新进展

介绍了绿色荧光蛋白的发光机理、基本性质和活体分子成像机制,分析了绿色荧光蛋白在肿瘤的转移机制、血管生成、药物筛选和疗效评判等光学成像技术中的最新应用.对活体分子成像的未来成像技术进行了展望.绿色荧光蛋白作为活体分子成像技术新的报告基因,在肿瘤的早期诊断及实时、无创监测肿瘤的发展变化等方面起了很大的作用,对肿瘤的诊断、药效学研究以及临床药物疗效的判定具有重大意义.     

荧光成像在活体蛋白质研究中的应用

蛋白质的动态特性对蛋白质在细胞内的功能有重要作用.荧光标记、活体内荧光成像技术及显微镜系统的共同进展为人们提供了活细胞内研究蛋白质动态变化及其相互作用的手段.综述了荧光成像技术的进展及其活体内研究蛋白质动态特性中的应用.     

基于GFP-nanobody的纯化酵母表达RIIIJ-GFP蛋白研究

采用大肠杆菌重组表达GFP-nanobody后,将其与琼脂糖凝胶偶联,对酵母菌分泌表达RIIIJ-GFP蛋白纯化. 荧光显微镜下观察到绿色荧光凝胶珠,SDS-PAGE检测GFP-nanotrap纯化的蛋白条带单一,且胶上可直接观察到GFP绿色荧光. 表明大肠杆菌表达的GFP-nanobody具有生物活性,可高效结合RIIIJ-GFP,这为RIIIJ蛋白功能的研究奠定基础.     

慢病毒介导的外源基因在人牙髓干细胞中的表达

牙髓干细胞（dental pulp stem cells,hDPSC）是牙源性的间充质干细胞,具有多向分化潜能.已有的研究表明,一些蛋白因子能够诱导牙髓干细胞的牙向分化,但尚无通过过量表达某些关键基因来诱导牙髓干细胞牙向分化的报道.利用绿色荧光蛋白作为报告基因,探究慢病毒介导的外源基因在牙髓干细胞中的表达,分离并鉴定人的恒牙牙髓干细胞,用携带绿色荧光蛋白标记的慢病毒原液感染DPSC,感染病毒后的DPSC进行传代以验证外源基因的稳定表达,并将感染慢病毒后的DPSC与羟基磷灰石/磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate,HA/TCP）混合移植到小鼠肾囊膜下培养8周.结果表明：用绿色荧光蛋白标记的慢病毒能够整合到牙髓干细胞的基因组中并获得稳定的表达,感染慢病毒前后的牙髓干细胞增殖率没有发生改变,感染病毒的hDPSC与HA/TCP混合移植到肾囊膜下仍能够产生牙本质牙髓样结构,因此利用慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白并不影响牙髓干细胞的生物学特性,说明在进一步利用慢病毒载体研究过量表达基因在牙髓干细胞牙向分化的作用中,绿色荧光蛋白可以作为标记蛋白.     

小时自制手榴弹的诺奖得主

2008年10月8日,美籍华裔科学家钱永健和日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲,三人因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出的贡献而共同获得了诺贝尔化学奖。其中钱永健在对绿色荧光蛋白的研究中，改进了其发光强度、发光颜色，阐明了发光原理，并发明出更多的应用方法，     

绿色荧光蛋白在细胞标记及活体示踪领域的应用

随着生命医学研究的不断深入,在微观世界探讨个体细胞的生理功能以及在人体内环境中观察和研究目的细胞与其他细胞间的相互作用时,就离不开细胞标记和活体示踪技术。而在众多细胞标记方法中,绿色荧光蛋白（GFP）凭借其标记细胞效率高,标记强度野强、示踪灵敏度高等优点近年来已经成为越来越多的科研工作者的首选细胞标记和示踪方法。现就绿色荧光蛋白在细胞标记及活体示踪领域的应用作一综述。     

荧光定量检测细胞绿色荧光蛋白技术的建立与应用

绿色荧光蛋白是在生化与分子生物学研究领域中普遍使用的一种基因表达报告系统显色物.对于细胞内绿色荧光蛋白表达水平的定量检测,目前尚缺乏一套准确﹑简便﹑易行的技术.本文以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,用分子量为25 ku的线性聚乙烯亚胺介导进入HeLa细胞并表达.利用多功能酶标仪测定细胞裂解液的荧光强度,结果显示:这种新方法测定的荧光强度能很好反映细胞中EGFP的蛋白表达水平,并在短时间内完成对EGFP表达水平的定量检测.该方法简单有效,且不依赖于大型仪器设备,具有较高的准确性与灵敏度,在实际应用中简便可靠,具有推广应用的意义.     

恒波长同步荧光法测定吐温80-硫酸铵液固萃取体系中绿色荧光蛋白标记的融合蛋白

培养了含六聚组氨酸绿色荧光蛋白修饰融合蛋白的工程菌,对从工程菌中收集的蛋白原液用普通荧光和恒波长同步荧光2种荧光表征方式进行了比较,探究了分离蛋白的液固萃取体系中各因素(如硫酸铵浓度、吐温80浓度、酸度)对蛋白质荧光特性的影响,确定了萃取体系中适用的恒波长同步荧光测定法.运用该法得到液相的工作曲线线性相关系数达0.999 35,固相工作曲线线性相关系数为0.997 48,原始吐温80-硫酸铵液固萃取体系分离菌中目标蛋白,一次萃取固相收得率可达41.31%,调节pH 6.2时一次萃取固相收得率可达63.24%,进一步提高选择性,加入聚乙二醇修饰物可提高至93.50%.     

绿色荧光蛋白基因在牦牛乳腺上皮细胞中表达的研究

从牦牛乳腺采集组织, 并通过胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法相结合在体外成功分离、纯化到了牦牛乳腺上皮细胞. 通过观察, 具有明显的上皮细胞特征, 而且符合一般细胞的生长规律. 通过脂质体介导法将携带有绿色荧光蛋白的外源基因转染进乳腺上皮细胞中, 在荧光显微镜下检测到了绿色荧光蛋白基因的表达.     

荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达

枯草芽孢杆菌是生物工业用的重要宿主体系。为实现荧光蛋白从分子水平定量追踪枯草芽孢杆菌培养过程的目的,构建了一系列整合型表达载体pX-GFPmut1和游离型表达载体pSW1-GFPmut1,pSW1-CFP,pSW1-YFP,研究了不同颜色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中整合型表达和游离型表达的差异。最适合的荧光蛋白表达体系是用游离型质粒pSW1-GFPmut1在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白GFPmut1。含pSW1-GFPmut1枯草芽孢杆菌通过木糖诱导表达GFPmut1后,细胞破碎后的荧光强度和细胞浓度呈线性关系。结果表明,利用枯草芽孢杆菌表达荧光蛋白可以实现利用荧光蛋白快速定量枯草芽孢杆菌培养过程。     

揭示生命奥秘的荧光——2008年度诺贝尔化学奖成果简介

瑞典皇家科学院将2008年度诺贝尔化学奖授予美国日籍科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·查非(Martin Chalfie)和美籍华裔科学家钱永健(Roger Yonchien Tsien),以表彰他们在发现荧光蛋白质、改造和开发其在生物及相关领域研究的应用中做出的杰出成就。下村修首先在水晶水母(Aequorea victoria)的发光器官里发现了绿色荧光蛋白质(Green Fluorescence Protein,GFP);查非的研究揭示GFP可以在别的生物如细菌和线虫表达、发光,并可用于各种蛋白质在生物体内的示踪;钱永健则对GFP的结构和发光机理进行了深入研究,将GFP改造成各种颜色的荧光蛋白质和多种便于使用的型式,使它们在各类研究甚至非研究领域中获得广泛应用。三人专业背景和贡献方式各不相同,就像一场最终获得冠军的接力赛跑,三人都扮演了关键的角色,对于强调创新的今天都具有深刻启示作用。     

使用差异定位SunTag组件实现对细胞质内高含量蛋白的活细胞观察（英文）

生物过程由数百万个蛋白质驱动.蛋白质结构和蛋白质定位是蛋白质行使功能的关键.在过去的研究中,快速发展的荧光显微镜成像技术使研究人员可以直接观察蛋白质在活细胞内的定位.然而,对细胞质内高含量蛋白的活细胞观察仍然存在技术障碍.我们通过改进SunT ag标记技术,使用差异定位的SunT ag组件:一方面,在研究目的蛋白(POI)上标记多个V4抗原;另一方面,将识别V4抗原的抗体GCN4融合的绿色荧光蛋白(GCN4-GFP)通过差异定位后限制其与抗原的结合量.我们的方法大大降低了背景荧光信号,实现了对dynamin膜上功能单位的直接可视化.     

荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达

枯草芽孢杆菌是生物工业用的重要宿主体系。为实现荧光蛋白从分子水平定量追踪枯草芽孢杆菌培养过程的目的,构建了一系列整合型表达载体pX-GFPmut1和游离型表达载体pSW1-GFPmut1,pSW1-CFP,pSW1-YFP,研究了不同颜色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中整合型表达和游离型表达的差异。最适合的荧光蛋白表达体系是用游离型质粒pSW1-GFPmut1在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白GFPmut1。含pSW1-GFPmut1枯草芽孢杆菌通过木糖诱导表达GFPmut1后,细胞破碎后的荧光强度和细胞浓度呈线性关系。结果表明,利用枯草芽孢杆菌表达荧光蛋白可以实现利用荧光蛋白快速定量枯草芽孢杆菌培养过程。     

绿色荧光蛋白基因转化内生解淀粉芽孢杆菌的研究

通过重叠延申法将枯草芽孢杆菌的启动子PSJ2与绿色荧光蛋白基因（gfp）的ORF连接起来,构建绿色荧光蛋白表达盒,再通过Rco R I和Pxt I双酶切将表达盒连接到pUS186载体上,转化解淀粉芽孢杆菌TB2菌株,得到可发出绿色荧光工程菌,工程菌对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用与野生菌株相当。