日本鳗鲡抗菌蛋白BPI基因的克隆、鉴定与表达

为探究鱼类抗菌肽—杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)的功能,从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆和鉴定了两个BPI基因,命名为AJBPI-1和AJBPI-2。这两个抗菌肽均具有BPI超家族特征性的LPS结合结构域和脯氨酸富集区,其中AJBPI-1和AJBPI-2的N-端碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)的数量分别为12和35,表明前者对LPS的结合力较后者弱。Real-time PCR检测结果显示,AJBPI-1在正常养殖鳗鲡的肝脏中转录表达量最高,其次是头肾,而AJBPI-2则在中肾和头肾中转录表达量最高,其次是血液。Poly I:C和E.tarda诱导后,鳗鲡脾脏中AJBPI-1和AJBPI-2的表达量均显著上调(P0.05),AJBPI-1约为PBS对照组的4.0倍和3.3倍,AJBPI-2为PBS对照组的2.3倍和1.7倍;经LPS、Poly I:C和E.tarda刺激后,鳃中AJBPI-2表达量显著上调(P0.05),上调幅度最高可达到PBS组的2.5倍、17.0倍和7.0倍;而中肾只在LPS和Poly I:C刺激时,AJBPI-1和AJBPI-2的表达量显著上调(P0.05),AJBPI-1约为PBS对照组的3.0倍和2.2倍,AJBPI-2为PBS对照组的2.0倍和2.2倍。     

斜带石斑鱼干扰素调节因子8基因的鉴定与表达模式分析

干扰素调节因子8(IRF8)是IRF家族转录因子中的一个成员.利用简并PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IRF8基因(EcIRF8)全长cDNA序列,其编码422个氨基酸残基的蛋白质,含有脊椎动物IRF家族的特征性结构域,即N端保守的DNA结合结构域(DBD)和C端多样化的干扰素调控因子结合结构域(IAD),其中DBD中包含5个特征性的色氨酸残基和1个核定位信号.与绝大多数脊椎动物的IRF8基因相似,EcIRF8基因组序列也是9个外显子和8个内含子的结构.EcIRF8在斜带石斑鱼肝脏中高水平表达.活体聚肌胞苷酸刺激后6h,EcIRF8在头肾、中肾、胸腺、肝脏和肠中的表达量显著上调(p0.05),其中在中肾中上调幅度最大,是对照组的106倍;副溶血弧菌(Vibrio paraheamolyticus)刺激后24h,EcIRF8在肝脏中的表达量也显著上调(p0.05),但上调倍数仅为对照组的9.37倍.结果表明,EcIRF8基因可能主要参与斜带石斑鱼的抗病毒免疫反应.     

免疫相关基因在健康革胡子鲶不同组织的表达分析

应用荧光定量PCR法分析抗菌肽hepcidin、c型溶菌酶和MHCⅠ基因在健康革胡子鲶肝胰脏、脾脏、胃、肠道、肾脏、头肾、心脏、脑、鳃、鳃上器官、背部皮肤、背部肌肉和尾鳍13种组织中的表达.结果显示:3种基因在以上组织中均有表达,Hepcidin基因在脾脏中表达最高,显著高于除肾脏以外的其它组织(P0.05);c型溶菌酶基因在胃中表达量最高,与其余组织的表达差异显著(P0.05);而MHCⅠ基因在脾脏和鳃中表达量相对较高,但13种组织间的表达差异不显著(P0.05).     

日本鳗鲡γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)基因的克隆鉴定与表达分析

在日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆获得2个γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)基因AjGILT-1和AjGILT-2,并对其序列进行生物信息学分析,进而利用实时荧光定量PCR分别检测2个基因在不同组织器官中的表达水平,及其在脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的表达变化.结果显示:2个基因编码的蛋白序列中均含有GILT家族的特征序列CQHGX2ECX2NX4C、活性位点CXXC、2个糖基化位点和11个保守的半胱氨酸残基,基因组序列均含7个外显子和6个内含子.2个基因启动子中都存在多个转录因子结合位点,如γ-干扰素活化位点以及特化蛋白1结合位点;不同的是AjGILT-1启动子区存在多个核因子-1、激活蛋白-1结合位点及干扰素刺激反应元件,而在AjGILT-2启动子区未发现.AjGILT-1在鳃和肠中表达量最高,而AjGILT-2在性腺、头肾和脾脏中表达量最高;除肠道外,同一组织中AjGILT-2的表达量均高于AjGILT-1.LPS、PolyI:C刺激和E.tarda感染后,AjGILT-1与AjGILT-2的表达在鳃中仅有少数变化,而在头肾和中肾中则变化较明显.综上所述,AjGILT-1和AjGILT-2基因可能参与了日本鳗鲡受病毒和细菌感染后的免疫应答.     

脂多糖对人卵巢癌细胞株IL-8 mRNA表达的影响

脂多糖(Lipopolysacchride,LPS)能够通过上调转移相关因子白介素8(Interleukin-8,IL-8)基因的表达促进癌细胞转移.为探究LPS对转移能力不同人卵巢癌细胞IL-8 mRNA表达的影响,我们以人低转移卵巢癌细胞株HO-8910和人高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM为实验材料,采用实时定量反转录-聚合酶链式反应技术(qRT-PCR)研究LPS刺激后,IL-8 mRNA表达的变化.实验结果表明:与HO-8910相比,在HO-8910PM中LPS显著上调IL-8基因的表达水平(P<0.05).我们推测LPS刺激IL-8基因在转移表型不同的卵巢癌细胞中表达的差异与癌细胞转移能力相关.     

油酸对子宫内膜癌细胞Ishikawa生物学行为的影响及机制初探

目的游离脂肪酸与肿瘤的发生发展密切相关,但在子宫内膜癌中的作用研究较少,本研究探讨不饱和脂肪酸油酸对人子宫内膜癌细胞Ishikawa生物学行为的影响及可能机制。方法将不同浓度OA刺激Ishikawa细胞作为实验组(OA作用组),并以空白组(未做任何处理)作为对照,用Cell Counting Kit (CCK-8)法检测OA对细胞毒性和增殖能力的影响,Transwell检测OA对细胞迁移、侵袭能力的影响。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测Bcl2、Ki67、MMP1、MMP9的mRNA表达水平。结果(1)不同浓度OA作用于Ishikawa细胞后,CCK8结果显示,50μmol/L、200μmol/L作用组细胞的活性在48 h显著高于空白对照组,差异有统计学意义(F_(48h)=2.504,P0.05);500、1000、1500μmol/L刺激组细胞的活性在不同时间点均显著低于空白对照组,差异有统计学意义(F_(24h)=3.625,P0.05;F_(48h)=9.318,P0.01;F_(72h)=36.630,P0.01;F_(96h)=47.871,P0.01),对细胞具有毒性作用。(2)50μmol/L及200μmol/L OA作用Ishikawa细胞48 h后,细胞的增殖能力显著高于空白对照组,差异有统计学意义(F_(48h)=2.504,P0.05),细胞的迁移及侵袭能力均显著高于空内对照组,差异有统计学意义(F_(迁移)=8.993,P0.01;F_(侵袭)=6.560,P0.01)。(3)200μmol/L OA作用于Ishikawa 24 h后,Bcl2、Ki67、MMP9的mRNA表达水平显著高于空白对照组,差异有统计学意义(F_(Bcl2)=7.232,P0.05;F_(Ki67)=6.245,P0.05;F_(MMP9)=3.837,P0.05),MMP1的mRNA表达水平高于空白对照组。结论不饱和脂肪酸OA可能通过上调Bcl2、Ki67、MMP9等基因的表达,促进子宫内膜癌细胞Ishikawa的增殖、迁移和侵袭。     

饥饿再投喂对鳜肌FSRP-1、FSRP-3和肠道PepT1基因表达的影响

为探讨饥饿再投喂对鳜肌FSRP-1、FSRP-3和肠道中PepT1基因表达的影响,本研究采用qRT-PCR技术,测定饥饿7d再饱食一餐后0、1、3、6、12、24、48、96h条件下鳜肌中FSRP-1、FSRP-3和肠道中PepT1基因表达水平的变化,研究结果表明:FSRP-1基因表达在投喂后12h内显著升高(P0.05),12-48h维持在较高表达水平,48h后显著降低(P0.05);FSRP-3基因表达在投喂后1h内显著降低(P0.05),12h达到峰值且表达量是1h的5倍,48h后显著降低(P0.05);PepT1基因表达在投喂后6h内显著降低(P0.05),48h时表达量最高。FSRP-1、FSRP-3和PepT1是与鱼类生长相关的重要基因,受饥饿再投喂的影响较大。     

嗜水气单胞菌感染对美洲鳗鲡血液和生化指标的影响

为研究自发病美洲鳗鲡分离的嗜水气单胞菌对该鱼的致病性,试验将60尾美洲鳗鲡平均分为对照组、浸泡组和注射组3组,3组鳗鲡分别注射PBS、以1.0×107cfu/mL的嗜水气单胞菌浸泡和1.0×108cfu/mL嗜水气单胞菌注射感染.各组鳗鲡分别于处理后6 h和30 h断尾采血并分离抗凝血和血清,抗凝血由血常规检测分析仪检测7项血液指标,血清由全自动生化分析仪检测13项与免疫相关的生化指标,数据用SAS软件进行统计学分析.结果表明,鳗鲡注射感染后6 h,与浸泡组相比,血清谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)的比值显著(P0.05)升高,其他指标在三组间均无显著(P0.05)差异.鳗鲡注射感染后30 h,同对照组和浸泡组相比,血清总蛋白和血糖极显著(P0.01)下降,Na+和Cl-浓度显著(P0.05)下降,而AST和ALT则均极显著(P0.01)上升.     

铜绿假单胞菌phzR对生物被膜基因转录及细胞运动性能的影响

为预测高产吩嗪类物质铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)工程菌株PA2019NES在农用开发时的生物安全性，本文采用实时荧光定量PCR技术，研究多拷贝phzR基因的PA2019NES与PA2016NX1在生物被膜状态(被膜态)、浮游状态(浮游态)的生物被膜、群体感应系统、六型分泌系统共9个基因转录量差异，结果显示：在浮游态下，多拷贝phzR基因上调vgrG、algD基因的mRNA转录量(P<0.05),下调pilA基因mRNA合成(P<0.05),但其他6个基因的转录量无显著差异(P>0.05);在被膜态下，仅提高rhlI基因的mRNA表达量(P<0.05),而fimX和wspR基因的mRNA合成受到抑制(P<0.05),但其他6个基因的转录量无显著影响(P>0.05);经24 h培养后，PA2016NX1和PA2019NES的蹭行运动无显著差异(P>0.05),但游泳运动后者强于前者(P<0.05),集群运动后者弱于前者(P<0.05)。此结果证明PA2019NES的条件致病性能可能不低于PA201...     

Sp1调控FoxM1在卵巢癌中的表达

探讨Sp1调控转录因子FoxM1在卵巢癌中的表达。免疫组织化学染色验证FoxM1在卵巢癌组织中高表达,Spearman'rho秩相关分析Sp1与FoxM1在卵巢癌组织中的表达相关性;双荧光素酶报告系统检测Sp1对FoxM1的调控作用;Real-time quantitative RT-PCR和蛋白免疫印迹技术验证Sp1对FoxM1的调控作用。FoxM1在大于60%的卵巢癌组织中呈阳性表达(阳性率33/42≈79%),并且与Sp1的表达显著相关(r=0.809,P0.01);Sp1可以结合并激活Foxm1启动子(P0.05);上调Sp1表达可以激活FoxM1在卵巢癌中的表达(P0.05),而干扰Sp1后可以下调FoxM1的表达(P0.05)。Sp1参与调控增殖相关转录因子FoxM1在卵巢癌中的表达。     

lgtF,rfaF和rfaD基因在副猪嗜血杆菌LOS诱导BALB/c小鼠炎性因子表达中作用的研究

为了研究lgtF,rfaF和rfaD基因在副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)脂寡糖(LOS)刺激BALB/c小鼠炎性因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α表达中的作用。提取HPS SC096株、lgtF基因缺失株(ΔlgtF)、rfaF基因缺失株(ΔrfaF)和rfaD基因缺失株(ΔrfaD)的LOS,用80μg HPS-LOS,ΔlgtF-LOS,ΔrfaF-LOS和ΔrfaD-LOS腹腔注射BALB/c小鼠,分别在6 h和12 h后去眼球采血,分离血清,运用商品化的ELISA试剂盒检测炎性因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量变化。结果表明用80μg HPS-LOS刺激BALB/c小鼠6 h和12 h后IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量均升高,显著高于ΔlgtF-LOS,ΔrfaF-LOS和ΔrfaD-LOS刺激BALB/c小鼠后的IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量(P0.05)。以上实验结果首次证实了lgtF、rfaF和rfaD基因在HPS LOS刺激BALB/c小鼠炎性因子表达过程中起着重要的作用。     

Djhsp70-4基因在日本三角涡虫中的功能分析

热休克蛋白70(HSP70)在细胞保护等方面起着关键作用,但至目前为止,在日本三角涡虫(Dugesia japonica)中,HSP70的具体功能尚不明确.以再生能力极强的日本三角涡虫为实验材料,从转录组数据库中筛选了在再生过程中显著调高的Djhsp70-4基因进行研究.实时荧光定量PCR结果显示:在受到外界刺激后,Djhsp70-4基因的表达量显著上调.通过整体原位杂交技术,观察到Djhsp70-4基因在整体涡虫身体两侧及再生芽基处有较强的杂交信号.利用RNA干扰技术敲低Djhsp70-4基因的表达量后,整体及再生组涡虫出现头部溶解现象.综上所述,Djhsp70-4基因可能在日本三角涡虫的稳态维持以及再生方面发挥重要作用.     

大熊猫白血病抑制因子RNAi干扰载体的构建及应用

旨在构建大熊猫白血病抑制因子(LIF)RNAi重组质粒,以期进一步研究LIF对大熊猫骨髓间充质干细胞(PDBM-MSCs)的调控作用.试验设计3组大熊猫LIF shRNA慢病毒pLKO.1 puro-LIF-down干扰载体,通过慢病毒的方式感染PDBM-MSCs,经q-PCR鉴定重组质粒pLKO.1 puro-LIF-down-1抑制效果最显著.pLKO.1 puro-LIF-down-1实验组和空质粒对照组比较发现,LIF mRNA表达水平抑制后能够显著下调细胞周期调控基因CDK2、CCNB2、CCND3的mRNA表达水平(P<0.05);显著上调凋亡基因P53、P16、P27、caspase3的mRNA表达水平(P<0.05);显著下调干性基因KLF4、SOX2的mRNA表达水平(P<0.05).以上结果表明,此次研究成功构建出大熊猫LIF RNAi干扰载体,LIF对PDBM-MSCs的生长和干性维持具有重要的调控作用,为大熊猫干细胞的体外培养及干性机制的研究奠定基础.     

七鳃鳗CD63的分子克隆、生物学特性及表达分析

从日本七鳃鳗和东北七鳃鳗中克隆得到了CD63基因的ORF区,预测了其编码的氨基酸序列.利用生物信息学方法进行了氨基酸序列分析并构建了进化树.实时定量PCR技术分析表明:CD63在日本七鳃鳗的心脏、肝脏、肌肉、髓、鳃、肠和卵中均有表达.其中,在卵中的表达量最高.脂多糖(LPS)体内刺激日本七鳃鳗后发现,CD63在肝脏和肌肉中的表达显著升高.本研究为进一步了解CD63分子在七鳃鳗的免疫方面的作用提供了实验依据.     

KP-10对绵羊卵泡颗粒细胞增殖及凋亡相关基因表达的作用研究

目的：探讨Kisspeptin-10(KP-10)对绵羊卵泡颗粒细胞(FGCs)CCND1、CDK6、Bcl-2、THBS1、TNC和Bax基因表达的影响.方法：将分离培养的原代FGCs细胞在含不同浓度(0、10、100和1 000 nmol/mL)KP-10培养基中培养，分别标记为CG组、EP-1组、EP-2组和EP-3组，采用CCK-8法检测FGCs的细胞活性，筛选出KP-10对FGCs增殖的最佳浓度与时间.采用RNA-seq技术进行转录组测序分析，应用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western Blot方法进行验证.结果：与CG组比较，48 h时EP-2组FGCs细胞活力极显著增强(P<0.01).转录组测序显示CG组和KP组间存在202个差异表达基因，其中上调基因119个，下调基因83个.qPCR和Western Blot结果表明，KP组CCND1、CDK6、Bcl-2基因表达显著上调(P<0.05);Bax、THBS1、TNC基因表达显著下调(P<0.01;P<0.05),与转录组测序结果基本一致.Western Blot验证结果与qPCR检测结果...     

多种环境雌激素低剂量联合处理诱导斑马鱼精子发生障碍

用E2、EE2、DES、4-t-OP、4-NP、BPA等6种环境雌激素暴露雄性斑马鱼(Danio rerio)成鱼120d。对暴露后斑马鱼精巢的组织学观察发现,其中精子的发生被明显抑制,精子大量丢失,出现空腔;早期生殖细胞大量增生。采用半定量RT-PCR对暴露后斑马鱼精巢发育和精子发生相关基因的表达进行研究,结果表明联合处理后,斑马鱼精巢中雄激素合成酶基因P450 11β、cyp17a1的表达显著下调(p0.05),而孕激素合成酶基因20β-hsd和雌激素合成酶基因cyp19a1a的表达量没有显著变化,但雌激素受体基因esr1的表达则显著上调(p0.05);减数分裂标记基因dmc1没有显著变化,而scp3基因的表达则显著下调(p0.05)。另外,视黄酸(Retinoic acid,RA)合成酶基因aldh1a2的表达显著上调(p0.05),而RA降解酶基因cyp26b1的表达则无显著变化。研究推测多种环境雌激素的联合处理可能通过下调雄激素合成酶的表达、上调雌激素效应和增强减数分裂起始并抑制减数分裂后期过程诱导斑马鱼成鱼精子发生障碍;因此多种环境雌激素低剂量联合暴露对渔业资源造成的生殖风险值得警惕。     

日本沼虾表皮Serpin基因克隆及免疫功能的初步研究

丝氨酸蛋白酶级联反应介导的黑化是甲壳动物重要的免疫反应,丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor, Serpin)是黑化反应的重要调节因子,而甲壳动物表皮Serpin的有关研究较少.为了探索表皮Serpin在日本沼虾(Macrobrachium nipponense)免疫反应中的功能,基于前期转录组数据,利用PCR、RACE和生物信息学从日本沼虾表皮克隆并鉴定了1个新的Serpin基因,命名为MnSerpin,利用RT-qPCR和RNAi等方法,研究了该基因时空表达模式、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒后表皮MnSerpin的转录水平以及日本沼虾死亡率的变化.结果显示,MnSerpin cDNA全长2 181 bp,编码419个氨基酸,具有Serpin结构域.MnSerpin在腹背部表皮、鳃、血细胞、胃、心、肝胰腺等多种组织均有表达;表皮MnSerpin的表达与蜕皮周期有关,与蜕皮间期(C期)相比,在蜕皮后早期(A期)最高,增加6.06倍(P<0.01).嗜水气单胞菌攻毒后,表皮MnSerpin的相对表达量在6 h达到...     

AA818342等6个新基因参与大鼠再生肝8种细胞的PLC信号转导

为了解AA818342、BM389035、BF289002、BF403759、AI170687、AI715484等6个新基因在PLC信号通路中的作用及与大鼠肝再生的相关性,分离大鼠再生肝8种细胞,检测它们的基因表达变化,分析新基因与已知基因的序列同源性、共表达关系及参与的生理活动.结果表明,AA818342与col8a1同源,在30 h和72 h再生肝的卵圆细胞中表达下调,在各期再生肝的库普弗细胞中表达上调.BM389035与itga1同源,在168 h再生肝的树突状细胞中表达下调.BF289002与gnai1同源,在12 h和168 h再生肝的卵圆细胞表达上调.BF403759与cacna1d同源,在2 h再生肝的星形细胞表达上调.AI170687与mef2c同源,在36 h再生肝的树突状细胞中表达下调.AI715484与prkce同源,在2 h再生肝的星形细胞中表达上调.上述基因转录谱预示,AA818342等6个新基因属于PLC信号通路成分,参与大鼠再生肝8种细胞的PLC信号转导.     

不同强度运动对青春期肥胖大鼠Vaspin的影响

目的:探讨不同强度运动对青春期肥胖大鼠Vaspin表达的影响.方法:建模7周后,取32只高脂诱导的肥胖倾向大鼠,随机分为4组,每组8只,分别为安静对照组(OC)、低强度运动组(OL)、中强度运动组(OM)、高强度运动组(OH).OL、OM、OH分别以15-18m/min、21-25 m/min和28-32 m/min以及坡度均为0°的强度运动,1h/d,5次/周,干预8周.8周后采集麻醉后大鼠血液及内脏脂肪组织,用qRT-PCR测脂肪组织Vaspin mRNA基因表达,免疫组化测脂肪组织Vaspin蛋白表达,ELISA测血浆Vaspin浓度.结果:8周不同强度运动干预后,大鼠体重、内脏脂肪重量、体脂率较OC均下降明显(P0.01),体重OL与OH差异显著(P0.05),OL的内脏脂肪重量和体脂率较OM、OH均有差异(P0.05、P0.01);内脏脂肪组织Vaspin mRNA基因表达量OC与OH存有显著差异(P0.05);OL、OM、OH的Vaspin蛋白表达较OC呈渐进式上升,强度越大,表达越明显;血浆Vaspin浓度OH较OC上调明显(P0.05).结论:实施8周不同强度运动后,较好地降低了青春期肥胖大鼠体重、内脏脂肪重量和体脂率,运动强度越大,效果越显著.不同强度运动干预显著上调了Vaspin mRNA基因表达量、Vaspin蛋白表达及血浆Vaspin浓度,运动强度越大,上调幅度越明显.     

日本鳗鲡不同组织器官的抗菌活性比较

用体积分数为10%的醋酸提取日本鳗鲡肝脏、鳃、脾脏、胆汁、肾脏和血清中的抗菌活性物质,检测其对养殖鳗鲡常见的4种致病菌,即肠杆菌Enterobacter sp.(B01)、迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda(B09)、气单胞菌属Aeromona sp.(B18)和嗜水气单胞菌Aeromona hydrophila(B27)的抑杀作用.结果显示:1)肝脏、脾脏、胆汁和鳃的样品对4株试验菌株均有明显的抑菌作用,肾脏的对B18、B27和B013株致病菌有抑菌作用,血清的仅对B18有抑菌作用.2)不同样品对同一种致病菌的抗菌活性差异显著(P0.05),按平均抑菌圈半径计算,其抗菌活性大体呈现为:肝脏鳃脾脏胆汁肾脏血清;同一样品对不同细菌的抑杀作用差异显著(P0.05).采用反相高效液相色谱法分析上述各组织/器官的醋酸提取物中的活性组分,结果显示:肝脏、脾脏、胆汁和鳃样品中的活性组分(以杀伤指数大于50%计)主要集中于乙腈洗脱质量分数为19.4%～35.4%时,肾脏和血清中没有明显的抗菌作用(杀伤指数小于50%).