一种定量检测大黄鱼感染变形假单胞菌方法的建立与应用

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicid)是引起大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要病原。基于变形假单胞菌的gyrB基因与大黄鱼的单拷贝基因gdf-8分别设计1对特异性引物,对所设计的变形假单胞菌gyrB基因的引物特异性进行了检验,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了400尾人工浸泡感染变形假单胞菌5 d后的大黄鱼幼鱼脾脏中的病原菌的相对含量。结果显示,基于gyrB基因所设计的引物对变形假单胞菌检测具有良好的特异性,可以用于对变形假单胞菌的定性和定量检测;400尾人工攻毒大黄鱼幼鱼脾脏中变形假单胞菌的相对含量(相对带菌量,用gyrB基因拷贝数与大黄鱼gdf-8基因拷贝数之比表示)变化在5.04×10~(-7)～0.482之间,不同个体之间的相对带菌量差异很大,说明不同个体的大黄鱼对变形假单胞菌感染的抵抗力有很显著的差异。     

大黄鱼trim38基因的克隆及其表达分析

］由变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）引起的大黄鱼（Larimichthys crocea）内脏白点病的死亡率可达50%~80%。对抗病相关基因trim38进行了分子及表达特征等分析。结果显示:该基因开放阅读框（ORF）1623 bp，编码540个氨基酸，预测蛋白分子量为61.58 ku，等电点6.99。qRT-PCR的结果表明，在所有检测的组织中都发现了trim38的转录产物，但在肾脏中的相对表达量最高。变形假单胞菌攻毒刺激后，大黄鱼脾脏中该基因持续表达，在120 h达到峰值；肝脏中3 h显著表达，之后相对表达量降低；肾脏中该基因相对表达量变化不大，在96 h左右达到最大值。上述结果表明trim38基因参与了大黄鱼应对变形假单胞菌感染的抗病免疫过程。     

褐球固氮菌和荧光假单胞菌原生质体制备条件的研究

为了利用原生质体融合技术获得同时具备固氮、解磷、抑病等活性的多功能菌株,本文对褐球固氮菌A41和荧光假单胞菌P32原生质体的制备条件进行了研究。通过对菌龄、酶解温度、酶浓度、酶解时间等影响因素的正交实验确定了褐球固氮菌A41和假单胞菌P32原生质体制备的最佳条件。实验结果表明,固氮菌A41最佳制备条件为菌龄20h、酶解温度37℃、酶浓度3mg/mL、酶解时间45min;假单胞菌P32最佳制备条件为菌龄20h、酶解温度37℃、酶浓度2mg/mL、酶解时间30min。     

斑节对虾病原菌河流弧菌(I型)的研究

从患"红体综合症"的斑节对虾(penaeus monodon)体内分离到一株细菌6101号,回归感染证实了其致病性,经形态观察以及生理生化特性检测,鉴定为河流弧菌(I型)．提取河流弧菌6101号胞外产物,分析其酶成分,定量检测了胞外产物中蛋白酶、酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶的活性,将提取的河流弧菌6101号胞外产物对健康斑节对虾进行致死试验,证实其胞外产物所具有的毒性甚于该菌的菌悬液．电镜观察致死对虾肝组织细胞严重受损,从细胞病理方面进一步证实了病原菌胞外产物的致病性．     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)X93胞外产物对病原弧菌抑制效果的研究

采用平板扩散法对从健康大黄鱼肠道中分离筛选到的对病原弧菌有抑制作用的短小芽孢杆菌(Bacillus pumi-lus)X93胞外产物(Extracellular products,ECP)作用的环境影响因子进行了研究。结果显示,菌株X93胞外产物的抑菌活性强弱随着培养时间的不同而不同,胞外产物对pH条件有一定的耐受性,对热敏感,不耐高温,过高的NaCl能使其抑菌活性降低,蛋白酶K和不同浓度的FeCl3均对其抑菌活性产生影响,其胞外产物发挥最大抑菌作用的最适培养时间、温度、pH、盐度分别为48 h、28℃、pH 7和0.5%。     

培养基成份对链格孢霉胞外蛋白酶的影响

本文研究了培养基成份对链格孢霉（Alternaria atternata)胞外蛋白酶形成的影响，发现，培养基成份对链格孢霉胞外蛋白酶的形成与活性有明显影响。链格孢霉只有在含1%酪素的培养基里才能形成胞外蛋白酶，否则不形成胞外蛋白酶，硫酸镁（MgSO4)对其蛋白酶活力有明显正向影响；磷酸氢二钾（K2HPO4）对其蛋白酶活力有明显负向影响；硝酸钠（NaNo3)对其胞外蛋白酶的形成具有明显负向影响。     

导入脂肪酶基因提高荧光假单胞菌26-2的产酶效率

采用导入脂肪酶基因的方法对荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescence）26—2的产酶效率进行实验。实验以质粒ppic9k—lipA为模板,通过PCR的方式在26—2脂肪酶基因的两端引入BamHl和EcoR1的酶切位点,并将该基因与大肠杆菌荧光假单胞菌穿梭质粒pDSK 519连接,获得重组质粒pDSK519-lipA,再将重组质粒转入荧光假单胞菌26—2,获得工程菌株P．fluorescence 26—2—1。在相同的发酵条件下,工程菌株的发酵液酶活力比原始菌株的发酵液酶活力提高2倍,实现了荧光假单胞菌脂肪酶基因的同源性表达。     

假单胞菌褐藻胶裂合酶活性片段的基因克隆及重组表达条件的优化

为分析假单胞菌（Pseudomonas）膜周质中褐藻胶裂合酶（alginate lyase,AlgL）的最小活性单元,进行了活性片段的初步研究.用简并引物克隆MY01菌株中AlgL基因的片段,用特异引物扩增目的序列并克隆入pBAD gⅢ/A载体,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆.进行L-阿拉伯糖诱导表达条件的优化,超声破碎重组菌体并分离水溶性组分作为粗酶,以褐藻酸钠为底物进行酶解反应,在235 nm测定产物的吸收值.结果该基因片段300 bp大小,GenBank收录号为AY736133,所编码的氨基酸序列中含有基序“NNHSYW”,且在系统发育树中与假单胞菌的AlgL聚类.在优化条件下获得粗酶,酶解反应产物在235 nm有显著吸收,表明重组融合蛋白具有褐藻胶裂合酶活性.褐藻胶裂合酶的研究较多,但其活性片段的重组表达研究少见报导.     

类产碱假单胞菌谷氨酸脱氢酶酶学性质的研究

类产碱假单胞菌的谷氨酸脱氢酶水平受氮源调节,以氮为唯一氮源时酶水平有明显提高,研究表明,该酶的最适反应温度为５０℃,催化氢化反应和脱氨反应的最适ｐＨ值分别为８．０和８．８,金属离子及嘌呤核苷酸对酶活力的影响不显著。     

病原芽胞杆菌几丁质酶产生菌的筛选与活性鉴定

通过特异引物PCR方法和水解圈活性法对62株苏云金芽胞杆菌菌株、26株蜡状芽胞杆菌菌株及18株球形芽胞杆菌菌株进行了几丁质酶产生菌的筛选.所测苏云金芽胞杆菌中除4株野生型菌株外均为阳性结果,蜡状芽胞杆菌仅1株为阴性结果,球形芽胞杆菌全为阴性结果,且水解圈法观察结果与PCR检测结果一致.在此基础上,通过DNS比色法对几丁质酶产生菌株的几丁质酶比活力也进行了测定.对这些具有致病性的病原芽胞杆菌几丁质酶的研究对于研究其致病机理及对其进行遗传改良具有重要的理论和实际应用价值.     

α-淀粉酶产生菌的平板筛选法的研究与改进

用平板水解圈法筛选到若干株 α 淀粉酶产生菌,它们的平板水解圈直径大小与摇瓶酶活不相关,进一步研究了３０ ℃平板淀粉的质量分数对水解圈直径的影响以及淀粉的质量分数、温度、琼脂等多种因素对离体 α 淀粉酶水解圈直径的影响,并在此基础上建立了一种快速筛选高产菌株的简便方法。     

悬铃木白粉病病原菌及其生物学特性

对近年来在南京、上海、杭州等地危害较为严重的悬铃木白粉病病原菌的无性型和有性型进行了形态学观察和分子生物学鉴定。结果表明,该病害病原的无性型为粉孢属一种(Oidium sp.),病原的有性型为孓蠹菌门的Erysiphe platani。病原菌生长的适宜温度为20~28 ℃,最适温度为26 ℃;湿度对孢子萌发的影响不大,一般环境湿度下都可萌发;分生孢子寿命约为13 d。     

[Ni(phen)_3]_2[NiMo_(12)P_8O_(62)H_(18)]单晶材料催化合成阿司匹林的研究

采用水热合成法制备[Ni(phen)3]2[NiMo12P8O62H18]单晶材料,通过考察反应温度、时间及催化剂用量等影响因素,确定了其催化合成阿司匹林的最佳条件为催化剂用量为0.09g,反应温度为80℃,反应时间为15min.表明[Ni(phen)3]2[NiMo12P8O62H18]单晶材料是一种催化合成阿司匹林的绿色、高效催化剂,可以为解决当前硫酸催化合成阿司匹林所产生的低效、污染及高成本的问题提供参考.     

盐度、温度和pH对2株海南地衣芽孢杆菌相对蛋白酶活性的影响

采用脱脂牛奶平板法,测定了不同盐度、温度和pH对2株分离白海南热带海水养殖系统的地衣芽孢杆菌（Bacillus lichen@rmis）Pb．WC09001和Pb—WC09002的相对蛋白酶活性的影响．结果表明：随着盐度的增加,2个菌株的相对蛋白酶活性都趋于减弱,当盐度增加到50时,仅Pb-WC09001还存在一定的酶活性,其相对蛋白酶活性为1．56U·mL-1,说明Pb—WC09001对高盐度环境的适应性更强．此外,还测定了在18～38℃（以4℃为梯度差）范围内菌株的相对蛋白酶活性,当在与菌体培养相同的温度下测定培养液的酶活时,Pb-WC09001与Pb—WC09002酶活性最高的温度均为34℃;当在30℃测定2个菌株在不同温度下的培养液酶活时,酶活性最高的培养液所对应的培养温度分别为22℃和30℃,说明这2个菌株在相同温度下可产生不同的蛋白酶,同时,Pb-WC09001在低温环境下的相对酶活性强于Pb-WC09002．在30℃、盐度30、菌体终浓度为2×10^3／mL时,Pb-WC09001在pH8．0、Pb—WC09002在pH7．5时的酶活性最高,相对酶活均为2．74U·mL-1,因此,Pb-WC09001对海水环境（pH8．0—8．4）的适应性更强．     

白三叶草褐纹斑病病原菌生物学特性研究

从白三叶草褐纹斑病叶片上分离纯化得到病原菌束状匍柄霉[Stemphylium sarcinifoDne（Car．）Wiltsh．],并对该菌生物学特性进行研究。结果表明：病菌菌丝生长以燕麦片培养基（OA）为最适,适宜温度为15—30℃,最适温度为25％,最适pH值为8,菌丝致死温度为51℃（10min）,全光照菌丝生长最快;病菌分生孢子萌发最适温度为25℃,在pH值为7条件下萌发率最高,分生孢子致死温度为42℃（10min）,光照对孢子萌发影响不大。     

高铝TRIP钢的高温力学性能

利用Gleeble3500试验机研究汽车用C-Mn-Al系TRIP钢的高温力学性能,测定了零塑性温度和零强度温度,应用差示扫描量热法测定其相变区间,采用扫描电镜和光学显微镜分析了不同拉伸温度对应的断口宏观形貌及断口附近组织组成.该钢种零塑性温度和零强度温度分别为1425℃和1430℃,第Ⅰ脆性区间为1400℃~熔点,第Ⅲ脆性区间为800~925℃.第Ⅲ脆性区脆化的原因是α铁素体从γ晶界析出,试样从975℃冷却至700℃过程中,随着α铁素体析出比例的增大,断面收缩率先减小后增大.基体α铁素体比例为8.1%时(850℃),断面收缩率降至28.9%;而拉伸温度在800℃以下时,基体α铁素体比例超过16.7%,断面收缩率回升至38.5%以上.该钢种在1275.6℃时开始析出少量粗大的AlN颗粒,但对钢的热塑性没有影响.     

温度对甜菜种子萌发速率和线粒体活性的影响

研究了不同温度对甜菜种子萌发速率和线粒体活性的影响。在 7,14和 2 0℃中甜菜种子萌发 5 0 %需要的时间分别是 7,3和 2 3d ;萌发 5 0 %的热时间大约是 46℃·d。在 7,14和 2 0℃萌发的种子和幼苗的线粒体中 ,总蛋白含量以及细胞色素氧化酶 (CCO)和苹果酸脱氢酶 (MDH)的活性随着萌发进程增加 ;相对分子质量大约为 1880 0 ,35 0 0 0和 36 0 0 0的蛋白质随着萌发进程降低 ;相对分子质量大约为 2 2 0 0 0的蛋白质在 7℃中逐渐增加 ,在 14和 2 0℃中则先少量增加然后下降。 2 0℃中萌发的种子和幼苗的线粒体的CCO和MDH的比活性和总活性比在 7和 14℃中高。这些结果表明 ,萌发温度显著地影响种子的萌发速率、线粒体的CCO和MDH活性以及较小相对分子质量热休克蛋白 2 2     

Dawson结构多金属含氧酸盐热解性质研究

用变温XRD,变温IR以及TG-DTA等方法,系统地研究了具有Dawson结构的Ym Hn P2 M12 O62·qH2O(Y=K+,NH4+,Cu2+;M=Mo,W)的热解性质,获得了它们较为精确的热分解温度,对其热分解的判断方法提出了一些新的见解.结果表明,以钼为配位原子的Dawson结构钾盐,铵盐,铜盐分别在250℃,210℃,240℃发生了热重排,生成了具有Keggin结构的化合物.以钨为配位原子的钾盐在410℃也有相似的行为,但铵盐和铜盐却没有观察到类似的热重排现象,分别在400℃,450℃直接热分解为WO3.这些结果显示,热重排现象的发生可能与相应的Keggin结构化合物的热稳定性有关.     

高温和高盐对Nitrosomonas nitrosa WH-1氨氧化活性的联合影响

自养氨氧化细菌是污水处理中的重要细菌,但高温和高盐对其氨氧化活性的联合影响研究仍较为匮乏.该文以纯培养的自养氨氧化细菌Nitrosomonas nitrosa WH-1为例,采用响应面法测定了温度与盐浓度对N.nitrosa WH-1亚硝氮积累速率的联合影响,还测定了不同盐浓度条件(3～18 g·L^-1)和不同温度条件(36℃～48℃)下的最适温度、半数抑制温度和半数抑制盐度.发现高温与高盐对亚硝氮积累速率存在明显的交互作用,当温度由36℃升至42℃,半数抑制盐浓度由8.84 g·L^-1增至10.45 g·L^-1,而盐浓度为15～18 g·L^-1时的最适温度和半数抑制温度也显著高于盐浓度为3～12 g·L^-1时的情况.上述结果说明,高温可以缓解高盐所引起的抑制,且适度的高盐也可以提高自养氨氧化细菌的耐热性.     

速生杨木动态黏弹性与初始含水率的关系

对初始含水率分别为0%、12%、18%、30%、50%、80%、100%和水饱和8种速生杨木试件进行动态黏弹性分析,采用动态热机械分析仪(DMA)进行测定,其操作参数为:温度范围35～350℃,升温速度5℃/min,测量频率1、10、50 Hz。储能模量的变化趋势表明:含水率为0%的试件在95℃附近其储能模量出现极大值;含水率为12%、18%、30%试样的储能模量在75℃之前下降缓慢,在温度75～130℃之间迅速下降,含水率为12%试样的降幅最小;含水率为50%、80%、100%和水饱和试件的储能模量变化点在135℃之后,随含水率的增大储能模量转变点的温度增加,并在转变点处出现储能模量最小值。损耗模量的变化表明:在试验温度范围内含水率为0%的试件不发生玻璃化转变;在所有含水试件中,含水率为12%试件的初始损耗模量和发生次转变时的损耗模量均为最低,同含水率为18%和30%试件相比,发生次转变时温度最高,含水率为30%试样在所有含水试样中具有最大的黏性。损耗因子的变化表明:所有含水试样均发生玻璃化转变过程,含水率为30%试样的玻璃化转变温度最低。在1～50 Hz之间,不同频率对储能模量、损耗模量及损耗因子影响较小,随着测量频率的升高,各力学松弛过程的描述曲线向高温方向有微小移动。