一种定量检测大黄鱼感染变形假单胞菌方法的建立与应用

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicid)是引起大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要病原。基于变形假单胞菌的gyrB基因与大黄鱼的单拷贝基因gdf-8分别设计1对特异性引物,对所设计的变形假单胞菌gyrB基因的引物特异性进行了检验,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了400尾人工浸泡感染变形假单胞菌5 d后的大黄鱼幼鱼脾脏中的病原菌的相对含量。结果显示,基于gyrB基因所设计的引物对变形假单胞菌检测具有良好的特异性,可以用于对变形假单胞菌的定性和定量检测;400尾人工攻毒大黄鱼幼鱼脾脏中变形假单胞菌的相对含量(相对带菌量,用gyrB基因拷贝数与大黄鱼gdf-8基因拷贝数之比表示)变化在5.04×10~(-7)～0.482之间,不同个体之间的相对带菌量差异很大,说明不同个体的大黄鱼对变形假单胞菌感染的抵抗力有很显著的差异。     

50味中药与8种抗生素对变形假单胞菌的体外抑菌作用

用牛津杯法选择诃子、大黄、黄连等50种单方中药对变形假单胞菌、金黄色葡萄球菌进行体外抑菌试验,并选用抑菌作用较好的药物组成复方二联、三联中药,药物质量浓度为60,240 mg/mL。结果表明:单方中药中,诃子对变形假单胞菌抑菌作用明显,为极敏感;复方二联中药中,240 mg/mL的诃子+白芍等4种对变形假单胞菌的抑菌作用明显,为极敏感;复方三联中药中,60 mg/mL的黄连+板蓝根+黄柏等5种对变形假单胞菌的抑菌效果为极敏感,240 mg/mL的黄连+连翘+黄芪等6种对变形假单胞菌的抑菌作用为极敏感;变形假单胞菌对恩诺沙星、盐酸多西环素、硫酸新霉素及硫酸庆大霉素4种药物高度敏感。由此认为黄连+板蓝根+黄柏等11个复方三联中药与恩诺沙星对变形假单胞菌抑菌作用最强,同时筛选出多个抑菌作用效果良好的复方三联中药和抗生素,可用于鱼病防治研究。     

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens GcM5 1A菌株的 胞外木素过氧化物酶的部分纯化和鉴定

荧光假单胞菌GcM5 1A是松材线虫携带的一种致病菌。在GcM5 1A的培养液中发现有木质素过氧化物酶的活性，同时显示很强的毒性。通过对其胞外木质素过氧化物酶的酶学性质的初步研究发现：其最适温度为35 ℃，最适pH为4.0。在15~35 ℃、pH为6.0~9.0范围内，酶活保持相对稳定。NH2OH·HCl和KCN对酶活的抑制作用分别达到88 %和57 %，而NaN3对酶活的抑制作用只有15 %左右。Ca2+、Mn2+ 和Fe3+对其活性有增强作用，但是Hg2+ 和 Zn2+却有中等的抑制作用。KCN 和NH2OH·HCl抑制其酶活性分别达57 %、88 %，而NaN3的抑制率仅为15 %。吸收光谱显示该酶在406 nm处有一个Soret峰，加入1 mmol/L Na2S2O4后，吸光度出现了明显的下降，但Soret峰没有显著移动。     

铜绿假单胞菌耐药机理

铜绿假单胞菌是耐药性十分突出的一类院内感染条件致病革兰氏阴性细菌．本文从生物被膜、细胞密度依赖式毒力因子、外排系统、基因盒一整合子系统及铜绿假单胞菌噬菌体几方面对其耐药性机理进行了概述，并提出了未来对微生物耐药性研究和应用的一些策略。     

红假单胞菌的分离鉴定与生长特性

由青岛沿岸潮间带表层沉积物分离出４株光合细菌，经鉴定属于荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌。光照厌氧培养生长实验表明ＨＤ３的最适盐度为Ｓ＝１５－２５，ＰＳ２－２为一淡水菌株。菌株ＨＤ３的最适ＰＨ范围为６．３５－８．３。ＨＤ３、ＲＳ均不能利用硫化物且其生长受较高浓度的硫化物抑制。     

茶多酚对假单胞菌抑菌机理研究

以铜绿假单胞菌为研究对象,研究了茶多酚的抑菌作用和抑菌机理。首先通过抑菌实验确定了茶多酚对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为0.075%。研究了茶多酚对铜绿假单胞菌生长曲线的影响。通过茶多酚对碱性磷酸酶和三磷酸腺苷酶,以及细菌总蛋白和膜蛋白影响的研究,结果表明：茶多酚可以降低细菌体内的碱性磷酸酶和三磷酸腺苷酶的活性,对细菌总...     

荧光假单胞菌P32培养基的优选

本文对荧光假单胞菌P32的培养基成分进行了研究,利用正交试验筛选出产菌量较高的培养基,成分如下:(％,W/V)蔗糖6,甘油3,蛋白胨1,NH_4H_2PO_4,0.5.     

铜绿假单胞菌耐药性探讨

目的探讨临床铜绿假单胞菌耐药情况.方法对160株临床分离的铜绿假单胞菌进行15种药物敏感试验,用MH平板采用WHO推荐的K-B法.结果氨苄西林、复方新诺明、阿莫西林/克拉维酸耐药率在95%以上;头孢三嗪、头孢噻肟、替卡西林/克拉维酸、庆大霉素、哌拉西林、氧氟沙星等耐药率在40%～60%;哌拉西林/三唑巴坦、氨曲南、环丙沙星等耐药率在30%左右,阿米卡星、亚胺培南、头孢他啶等耐药率在20%以下.结论铜绿假单胞菌对氨苄西林、复方新诺明、阿莫西林/克拉维酸完全耐药,对碳氢酶烯类药物亚胺培南(11.9%)、头孢他啶(13.8%)耐药率最低;氨基甙类中的阿米卡星(20.1%)和环丙沙星(30%)耐药率相对较低.临床上宜选择耐药率＜20的药物;对耐药率在40%～60%的药物慎用;耐药率＞70%的药物最好不用.     

大黄鱼与黄姑鱼杂交F_1及其双亲的核型分析

研究了大黄鱼与黄姑鱼正反交F1原肠早期胚胎细胞及其亲本头肾细胞的染色体核型,为深入剖析大黄鱼与黄姑鱼杂交后代的基因组构成提供了细胞遗传学证据.大黄鱼与黄姑鱼染色体组均含有48条端部着丝粒染色体,染色体组型公式均为2n=48 t,染色体臂数均为NF=48,组内染色体长度分布连续.两亲本物种间核型很相似,未找到鉴别两物种的细胞遗传标志.正反交F1原肠期胚胎细胞的染色体众数也均为48,均可较好地配为24对.结合前期AFLP分析结果可以推断,正反交胚胎细胞均同时含有一个大黄鱼染色体组和一个黄姑鱼染色体组.此外,杂交F1中的非整倍体比例与两亲本没有明显区别,初步表明杂交胚胎细胞未发生明显的染色体丢失.在黄姑鱼♀与大黄鱼♂杂交F1中出现4对非t-染色体,原因尚待查明.     

大黄鱼Ghrelin基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR、RACE等技术,从大黄鱼胃组织中克隆得出Ghrelin基因的cDNA(649 bp),其中包含5'非翻译区(5'UTR),起始密码子,信号肽、成熟肽、C-端肽序列的编码区,终止密码子,3'非翻译区(3'UTR)和相对较少见的多核苷酸化信号(ATTAAA).获得的cDNA编码108个氨基酸,与已报道的硬骨鱼类Grelin mRNA比对显示,相似性(Similarity)和一致性(Identity)最高(黑鲷 Acanthopagrus schlegelii)可达81%和73%,推测的成熟肽包含硬骨鱼Ghrelin的相同活性中心和修饰位点,证明是鱼类Ghrelin同源基因.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)fAFLP方法的建立

以大黄鱼为材料,探索及优化了影响荧光标记AFLP(fAFLP)分析体系的主要因素.结果表明:内切酶EcoRⅠ与MseⅠ各0.35 U,双酶切350 ng大黄鱼基因组DNA,依次反应4 h可得最佳效果;T4DNA连接酶2.5 U,16℃过夜连接3μL酶切产物与接头时效果最佳;以1μL连接产物作底物,EcoRⅠ与MseⅠ预扩引物分别为0.3μmol/L与1.5μmol/L时预扩效果最佳;预扩产物稀释超过100倍作为选择性扩增的模板时致使某些样品的电泳条带缺失.使用该体系分析了一个野生大黄鱼群体的AFLP片段的多态水平,结果证明该方法简便有效,可用于群体遗传多态性分析.     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

大黄鱼40日龄体长和体重遗传力估计

应用数量遗传学原理和全同胞组内相关法估计了40日龄大黄鱼的体长和体重遗传力,通过巢式平衡设计和人工授精技术,构建了5个半同胞家系和15个全同胞家系,利用SAS 9.0软件的一般线性模型(GLM)计算表型变量的方差组分,估计体长和体重性状的遗传力.结果表明:大黄鱼鱼种阶段体重和体长遗传力分别为0.29和0.31.t检验显示两个性状遗传力的估计值均不显著,且雄性遗传方差组分大于雌性遗传方差组分,说明雄性遗传方差组分存在非加性效应或受环境影响较大.     

大黄鱼Rnd1基因表达载体构建及表达模式分析

为探究Rnd1基因在大黄鱼免疫应答过程中的作用,采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）对该基因的表达模式进行分析,同时构建原核表达载体pET-28a-Rnd1,并转化进大肠杆菌后诱导该蛋白的融合表达。研究结果表明:大黄鱼Rnd1基因ORF为699 bp,编码232个氨基酸;经序列多重比对和进化树构建发现,Rnd1的氨基酸序列高度保守;在健康大黄鱼的8个免疫组织中,Rnd1在肝脏中相对表达量最高,其次为脑,而在肠中表达量最低;变形假单胞菌攻毒后,Rnd1在肝脏中48 h时达到最高值,为对照组的25倍;在脾脏中则持续上调表达,尤其在48 h后升高更为明显。     

温度和体重对养殖大黄鱼能量收支的影响

主要分4个温度级、5个体重级研究了温度和体重对养殖大黄鱼能量收支的影响。结果表明,大黄鱼的代谢能(R)及排泄能(U)与温度成指数关系,关系式分别为R=107e0.0288T,U=38.6e0.0171(T15℃≤T≤30℃);大黄鱼代谢能和排泄能与体重呈负相关的幂指数关系,关系式分别为R=228W-0.150,U=61.5W-0.199,均符合Y=aWb模式。温度和体重对代谢能(R)和排粪能(F)所占摄食能(C)比例均有显著差异(P<0.05),生长能(G)所占比例随着温度上升和体重增加而有所下降。     

大黄鱼trim38基因的克隆及其表达分析

］由变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）引起的大黄鱼（Larimichthys crocea）内脏白点病的死亡率可达50%~80%。对抗病相关基因trim38进行了分子及表达特征等分析。结果显示:该基因开放阅读框（ORF）1623 bp,编码540个氨基酸,预测蛋白分子量为61.58 ku,等电点6.99。qRT-PCR的结果表明,在所有检测的组织中都发现了trim38的转录产物,但在肾脏中的相对表达量最高。变形假单胞菌攻毒刺激后,大黄鱼脾脏中该基因持续表达,在120 h达到峰值;肝脏中3 h显著表达,之后相对表达量降低;肾脏中该基因相对表达量变化不大,在96 h左右达到最大值。上述结果表明trim38基因参与了大黄鱼应对变形假单胞菌感染的抗病免疫过程。     

温度和盐度对大黄鱼生长性能的联合效应

以初始体重为（4.2±0.5）g的大黄鱼为试验对象,采用U5（52）均匀试验设计,研究在水泥池精养模式下温度和盐度对大黄鱼生长性能的联合效应.30 d的试验结果表明,合理的温度和盐度组合能明显优化大黄鱼的生长速率和饲料系数,即在温度24.1～24.7℃,盐度13.6‰ ～ 14.1‰的条件下,大黄鱼生长速率和饲料系数达到最优值,生长性能达到最佳效果.     

大黄鱼三倍体诱导的初步研究

以温度休克方法研究了养殖大黄鱼（Pseudosciaena crocea）三倍体诱导的处理条件,结果表明：1）采用体克和热休克方法均可诱导出三倍体大黄鱼,三倍体诱导率明显受处理温度、处理起始时间以及处理持续时间等因子的影响;2）4℃冷休克条件下,处理起始时间为受精后2min,处理℃持续时间为10min有较高的孵化率和三倍体诱导率;3）37℃热休克条件下,处理起始时间为受精后2．5min,处理持续时间为5min也可获得较高的孵化率和三倍体诱导率。