EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

从人血液中提取总DNA,利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因,将其插入表达载体pEGFP—C1的多克隆位点中,构建增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein gene,EGFP）和人肝细胞再生增强因子（human augmenter of liver regeneration gene,ALR）融合基因表达载体pEGFP／ALR,并将其转染Hela细胞系,用含G418的DMEM／F12培养液筛选转基因细胞,然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达,用荧光显微镜检测EGFP基因的表达．结果显示：得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体;在转基因细胞中,PCR扩增得到1．7Kb的ALR条带,蛋白电泳得到57KD大小条带．与ALR和EGFP融合蛋白大小相符;荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞．在转基因细胞中,EGFP和ALR同时存在并表达,绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达,从而简化了目的基因繁琐的检测手段．     

增强型绿色荧光蛋白表达对鼠C6细胞生物学特征影响的研究

脂质体包裹质粒pEGFP-N1转染C6细胞,经G418筛选,得到稳定表达绿色荧光的C6-EGFP细胞.细胞计数,MTT,流式细胞术分别测定C6细胞在转染绿色荧光蛋白后增殖性,细胞活力以及细胞周期等生物学特性.C6细胞在转染了绿色荧光蛋白基因后细胞增殖性降低,细胞活力降低,细胞周期也发生了一些改变.     

应用绿色荧光蛋白标记技术研究钙调激Ⅱ在HeLa细胞中的分布

采用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术研究钙离子钙调素依赖性蛋白激毒Ⅱ(CaMKⅡ）在HeLa细胞中的分布，为了研究细胞风钙离子钙调素信号的下游作用物，我们首先构建了CaMKⅡ与GFP的融合基因，磷酸钙沉淀法将pCaMKⅡ－GFP重组载体导入HeLa细胞，通过荧光显微镜观察，发现在细胞间期，CaMKⅡ－GFP融合蛋白主要分布于细胞核中，细胞质中亦有少量分布，这一分布不同于绿色荧光蛋白在间期细胞内的动匀分布，同时讨论了与间接免疫荧光染色方法相比，GFP技术在功能蛋白定位研究上的应用优势。     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌－杆状病毒穿梭系统将一套含有绿色荧光蛋白基因和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地殂多角体。     

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。     

绿色荧光蛋白在分子细胞生物学研究中的应用

绿我荧光蛋白具有优良的特性,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何外源底物或内源辅助因子的参入就能发出绿色荧光,绿色荧光蛋白基因的表达可用来监控活细胞或生物体中基因表达和蛋白质的定位,这是一个革命性的进展,而且,对基因ＤＮＡ序列的改造可能使绿色荧光蛋白的发光特性更加优良,从而共应用范围会更加广泛。     

绿色荧光蛋白基因在牦牛乳腺上皮细胞中表达的研究

从牦牛乳腺采集组织, 并通过胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法相结合在体外成功分离、纯化到了牦牛乳腺上皮细胞. 通过观察, 具有明显的上皮细胞特征, 而且符合一般细胞的生长规律. 通过脂质体介导法将携带有绿色荧光蛋白的外源基因转染进乳腺上皮细胞中, 在荧光显微镜下检测到了绿色荧光蛋白基因的表达.     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达与鉴定

SLC38基因家族编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白3(SNAT3)是System N中的一员.它在大脑谷氨酸-谷氨酰胺循环以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程中发挥着重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达与定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SNAT3的N末端连接,通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到pBK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒.用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞(HEK293T cells),利用激光扫描共聚焦显微镜和Western blot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位.结果表明,EGFPSNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上.EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能.     

绿色荧光蛋白α2b-干扰素融合蛋白的表达与活性研究

采用基因重组技术,构建原核表达质粒pET 32a( )/GFP-α2b-IFN,转化大肠杆菌BL 21,以IPTG诱导融合蛋白的表达并用镍金属螯合层析柱进行纯化.SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,46.0 kD的融合蛋白在大肠杆菌中得到了正确的表达,并具有α2b-IFN的抗原活性.受体结合实验表明,该融合蛋白能够与W ISH细胞上的干扰素受体特异性结合,并在激发光下呈亮绿色荧光.采用细胞病变法测定分离纯化的融合蛋白的抗病毒活性,比活力为1.0×107IU/m g.表达的GFP-α2b-IFN融合蛋白具有α2b-IFN的特性与荧光活性,为研究α2b-IFN受体功能以及IFN与细胞相互作用的机理奠定了基础.     

小鼠金属硫蛋白基因—I在CHO细胞中稳定表达及其在医疗…

将小鼠的ＭＴ－Ｉ基因插入ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ质粒的ＥｃｏＲＩ位点，构建了具有ＳＶ４０和ＭＴ双启动子并正向插入ＭＴ－Ｉ基因的表达载体。用改良的磷酸钙／ＤＮＡ沉淀法将表达载体导入ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞内，用不含次黄嘌呤（Ｈ）和胸腺嘧啶（Ｔ）的选择培养基筛选出稳定表达ＭＴ阳性克隆Ｄ－２２，经检测１０＾６细胞的ＭＴ表达量约为１．８μｇ，Ｄ－２２细胞对Ｃｄ＾２＋浓度抗性较之ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞高１４倍。     

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.     

人M-CSF与SCF融合蛋白的构建及其在昆虫细胞中的表达

应用重组DNA技术构建M-CSF与SCF的融合基因并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体pVL1392中,通过与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)DNA共转染草地夜蛾细胞Sf9,融合基因插入AcNPV基因组.重组病毒感染单层Sf9细胞后,表达产物分泌到胞外培养液中,用MTT比色法和TF-1细胞株可检测到表达产物与IL-3的协同效应.上述研究为开发具有应用价值的新型细胞融合因子奠定了基础.     

GST-hBLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBLyS (humanBlymphocytestimulator)基因序列设计合成特异性引物 ,用RT_PCR从人外周血淋巴细胞扩增出 85 8bp的hBLyS基因 ,并将其插入到融合蛋白原核表达载体 pGEX_4T_1中 ,得到重组表达质粒pGEX_4T_1/hBLyS。把此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,经用IPTG诱导 ,表达出了GST_hBLyS融合蛋白。     

Tat-p21融合蛋白的表达及其在A549细胞中的活性研究

在本研究中,通过分子克隆的手段,将编码Tat跨膜转运结构域的CDS与人野生型p21蛋白的CDS相连接,并通过原核表达系统表达纯化相应蛋白;然后用该蛋白按浓度梯度:100,200,400,800,1000nmol/L与A549细胞共同孵育,各浓度在10,60,120,240min终止反应,通过Western Blotting检测进入细胞的p21蛋白量,以此确定最佳的转导条件;接着检测了转导进入A549细胞的Tat-p21融合蛋白在细胞中稳定存在的时间.然后通过绘制细胞生长曲线的方法比较了转导Tat-p21的细胞与负对照实验组生长速度的区别.结果发现,融合Tat跨膜结构域的p21蛋白能够高效进入A549细胞,并在细胞内发挥相应生物学功能,使细胞的生长受到抑制,增殖减慢;而作为负对照的p21蛋白则无相应功能.     

增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建

构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3．1( )-EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记．     

绿色荧光蛋白在细胞标记及活体示踪领域的应用

随着生命医学研究的不断深入,在微观世界探讨个体细胞的生理功能以及在人体内环境中观察和研究目的细胞与其他细胞间的相互作用时,就离不开细胞标记和活体示踪技术。而在众多细胞标记方法中,绿色荧光蛋白（GFP）凭借其标记细胞效率高,标记强度野强、示踪灵敏度高等优点近年来已经成为越来越多的科研工作者的首选细胞标记和示踪方法。现就绿色荧光蛋白在细胞标记及活体示踪领域的应用作一综述。     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

小檗胺及其衍生物的结构对宫颈癌（HeLa）细胞生长增殖的影响

本文研究了不同结构的新型钙调查蛋白（ＣａＭ）拮抗剂－－小檗胺（Ｂ０）及三种衍生物ＥＢＢ、Ｂ４、Ｂ２）对宫颈癌细胞的生长曲线、单细胞克隆、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入、线粒全脱氢酶活性的影响，并测定了小檗胺类化合物作用ＨｅＬａ细胞后，细胞内ＣａＭ 变化，结果发现，四种小檗胺类化合物对ＨｅＬａ细胞的生长和增殖有明显的抑制作用；其抑制增殖的ＩＣ５０值分别为Ｂ０１２．５μｍｏｌ／Ｌ、Ｂ２２．０μｍｏｌ／Ｌ、Ｂ４２．     

c-fos启动子与GFP重组质粒的构建及在Pc12细胞中的表达

目的：构建c—fos启动子与GFP的重组质粒载体,并使其在体外培养哺乳动物pcl2细胞中表达．方法：Xba I、Hind Ⅲ双酶切含c—fos启动子的HF443质粒,纯化后与同样双酶切的绿色荧光蛋白基因连接;利用Lipofect AMINE 2000将重组质粒转染体外培养哺乳动物pcl2细胞．结果：加入Na^ 通道激活剂乌头碱后,转染后的pcl2细胞可发出较强的绿色荧光．结论：c—fos启动子与GFP重组质粒构建成功,并可用于哺乳动物活细胞c—fos基因的检测．     

EGFP-IgG4融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）和IgG4基因的融合蛋白真核表达载体pMM-EGFP-IgG4/WG,转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)中成功表达,并发出绿色荧光,证明pMM-EGFP-IgG4/WG是一种良好的生产分泌型外源融合蛋白的阳性对照.