抗汉坦病毒单链抗体双元载体的构建

利用PCR方法,从含有1A8 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点。经多步连接将其克隆入植物表达载体pBI121或pCAMBIA1305．2。酶切结果证明1A8 scFv基因被成功克隆入植物表达载体pBI121及pCAMBIA1305．2,构建获得1A8 scFv-p BI121及1A8 scFv pCAMBI A1305．2重组质粒,并将其转入农杆菌GV3101。抗汉坦病毒mAb 1A 8scFv植物双元表达载体的获得,为进一步在植物中表达该抗体片段奠定了基础。     

矮牵牛ACS2基因正、反义重复表达载体的构建

将矮牵牛ACS2基因的正义重复和反义重复分别与植物表达载体质：pBI-121连接,构建ACS2基因的正义重复和反义重复表达载体,经PCR和酶切鉴定,基因已成功构建到表达载体质粒上,为延长矮牵牛花期的基因工程研究奠定了基础．     

烟草反义Mlo基因表达载体的构建

获得烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo,为进行烟草遗传转化,获得该基因表达的缺陷型植株打下基础.从烟草叶片中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到Mlo基因的c DNA,以此为模板设计反义引物,通过PCR扩增出反义Mlo基因,将此反义Mlo基因与T载体连接,测序正确后再将此反义片段与植物表达载体pBI 121连接,构建烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo.经Kan选择筛选出反义重组菌落,碱裂解法小量提取质粒后,用Xba I和Bam HI双酶切后再进行电泳鉴定.结果表明,目的基因已与植物表达载体pBI 121连接成功.成功构建了烟草反义Mlo基因表达载体pBI 121-Mlo.     

布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株的构建与鉴定

为了构建布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,采用PCR方法分别从亲本株16 M上扩增omp31基因的侧翼看序列及枯草芽孢杆菌SacB基因,并将所得片段与pMD18-T载体相连并测序,利用双酶切的方法分别将其连入自杀载体pGEM-7zf+,获得亚克隆pGEM-7zf+-Δomp31-SacB。将所构建好的自杀载体通过电转化入布鲁氏菌16M感受态细胞中,经2次同源重组后筛选出16MΔomp31基因缺失株,并对获得缺失株进行遗传稳定性检测。结果显示:成功获得布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,该缺失株在15代内未发生回复性突变。本研究为今后研究布鲁氏菌抗凋亡机制奠定基础。     

抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建

利用PCR方法，从含有3G1 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因，并使基因两端携带合适的限制性酶切位点．将其克隆人植物表达载体pBI121，构建获得3G1 scFv-pBI121重组质粒．酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功，将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404，为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础．     

高山离子芥磷脂酶Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建

磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1 600bp,blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化PCR产物,克隆至pTG19-T载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础.     

重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因及其重组质粒构建

目的:利用重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因的全长序列.方法:对风疹E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠PCR法分别合成该基因的3个片段,测序鉴定后以酶切连接法将各段拼接成全长为1 443 bp的RV rE1,将E1基因的全长序列克隆导入原核表达载体pET32a.结果:分别进行8轮、5轮和6轮的重叠PCR扩增,合成风疹基因3个片段;以酶切连接法将3个片段拼接成全长rE1基因并克隆入pET32a构建成载体pET32-RV rE1,PCR、酶切和测序鉴定结果表明,合成的E1基因大小、序列与预期相符;构建获得重组质粒pET32-RV rE1.结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因并构建其重组质粒pET32-RV rE1.     

灯盏花CHI基因的再克隆及其绿色荧光蛋白表达载体构建

根据灯盏花转录组所注释的CHI unigene片段,设计了RACE相关引物,克隆到灯盏花CHI的cDNA全长序列,序列全长717bp,编码238个氨基酸.该氨基酸序列与我们前期所克隆的灯盏花CHI cDNA序列相比,在345、351位点发生了突变,碱基均由C突变为T,两个位点的突变均属于同义突变,编码的氨基酸分别为115、117位异亮氨酸、酪氨酸.同时将CHI基因片段插入到pDM 18-T,构建pDM 18-T-eBCHI中间载体.经测序验证后,根据pBI121-EGFP图谱,设计带有SalI、SpeI酶切位点的引物,以pDM 18-T-eBCHI中间载体为模板,扩增带酶切位点的CHI序列,扩增产物经回收、纯化后与双酶切的pBI121-EGFP链接,构建了重组表达载体pBI121-EGFP-CHI,CHI基因插入植物表达载体pBI121-EGFP的6xHis组氨酸标签与GFP基因间.经SalI、SpeI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明,CHI基因已成功地连接到pBI121-EGFP-eBCHI中.采用电击转化法将重组质粒导入根癌农杆菌GV3101,用叶盘法转化灯盏花叶片,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和叶绿素荧光成像检测证明,重组基因已成功地转化到灯盏花愈伤组织中.为利用转基因技术研究CHI基因的表达及其亚细胞定位打下基础.     

水蛭素基因植物表达载体的构建

在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下,根椐植物基因密码子选择偏向,对水蛭素基因序列进行了改造．在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、poly(A)尾、XbaⅠ和SacⅠ双酶切位点．将所合成序列与双元载体pBI121重组,构建成pBI121-hir植物高效表达载体．经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3种方法鉴定,该载体构建成功．     

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。     

带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.     

拟南芥转录因子CBF1基因杂交狼尾草的转化

CBF1转录激活因子是一类存在于拟南芥中受低温诱导的反式作用因子,能有效提高植物抗低温、抗干旱的能力.因此以拟南芥叶片为材料,通过PCR方法成功地克隆CBF1转录因子基因,并将其连接到植物表达载体pBI121上,通过农杆菌介导法转化杂交狼尾草叶片,成功获得转基因再生植株.     

花特异表达启动子的克隆及花色调节基因Lc表达载体的构建

克隆了矮牵牛花特异表达基因CHSA启动子，并定向插入到已含有花色调节基因Lc的质粒pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子．所构建的新表达载体可用于花色改良研究．     

小拟南芥ApCBF基因的克隆及转化烟草的初步研究

CBF是植物冷驯化过程中的关键性调节因子。利用PCR及染色体步移法从新疆特有拟南芥近源种植物——小拟南芥的基因组中克隆了CBF基因的同源序列（DQ207404）。生物信息分析表明，该序列具有完整的读码框，推定的蛋白质序列与拟南芥CBF1，2，3的相似性分别为：87．6％、86．6％和88．1％。以植物表达载体pBI121为基础，构建了由组成型启动子35S调控ApCBF的植物表达载体pCB111。通过根癌农杆菌介导，采用叶盘法转化烟草，PCR检测初步证明却ApCBF基因已整合到烟草基因组中。为利用ApCBF基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

农杆菌介导的白芥防御素基因对甘蓝型油菜的转化

通过根癌农杆菌介导将正向和反向插入白芥防御素基因的pBI121重组质粒转入甘蓝型油菜的下胚轴，经组织培养和抗性筛选获得再生植株. PCR检测后，初步鉴定为阳性植株.     

基因沉默抑制子HC-Pro表达载体的构建

RNA沉默广泛存在于植物等大多数真核生物中,能够防御外源基因的入侵和调控基因表达等.然而,基因沉默抑制子HC-Pro蛋白的具体功能的研究并不十分清楚.本文重点介绍了基因沉默抑制子HC-Pro的表达载体pBI121-HC-Pro的构建及HC-Pro基因在烟草(Nicotiana benthamiana)中的稳定表达.并利用半定量RT-PCR技术检测了目的基因HC-Pro的表达,检测结果表明我们获得了HC-Pro基因稳定表达的转基因烟草株系,为进一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能奠定了实验基础.