过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵L-异亮氨酸产量的影响.以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW基因组为模板克隆hom基因,将hom基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入C.glutamicum YILW构建C.glutamicumYILW(pXMJ19-hom).通过5,L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响.结果显示,重组酶的表达使菌株对L-苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强.最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36.5,g/L和2.8,g/L,分别较出发菌株提高7%和33%,同时L-赖氨酸合成量仅为2.1,g/L,较出发菌株降低了63.8%.     

瓜氨酸生产相关基因簇在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达

构建1种组成型载体并将载体应用在表达瓜氨酸相关基因簇argCJBDF上。通过去除pXMJ19诱导型启动子上游阻遏蛋白lacI基因的方法,构建组成型质粒pXMJ19-lacI,并将谷氨酸棒杆菌中合成瓜氨酸途径的基因簇argCJBDF克隆到改造过的组成型载体中,实现瓜氨酸合成相关基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌的组成型表达。结果表明:重组菌在30℃摇瓶发酵72 h后,N-乙酰谷氨酸激酶的酶活达到(0.323±0.015)U/mg,瓜氨酸的产量达到4.33 g/L。成功构建的组成型表达载体,实现了外源基因簇argCJBDF在谷氨酸棒杆菌中的组成型表达。     

谷氨酸棒杆菌生物合成L-鸟氨酸的代谢流分析

应用代谢流平衡模型,通过物料衡算和Matlab线性规划的方法得到谷氨酸棒杆菌1009生物合成L-鸟氨酸的代谢流分布与理想代谢流分布.结果表明:在分批培养条件下,生物合成L-鸟氨酸的过程中,有58.6%的C架进入糖酵解途径,41.4%的C架进入戊糖磷酸途径,L-鸟氨酸的产量达到理论最大产率的65.4%;与理论值相比,应降低三羧酸循环的代谢流,同时减少副产物氨基酸和有机酸的生成.     

谷氨酸棒杆菌发酵生产1,5–戊二胺的代谢流分析

为了提高糖类的利用效率,加强糖类代谢向生成尸胺的方向流动,提高尸胺产量,对谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢网络进行分析,找出影响尸胺合成的代谢流量分配规律和关键节点,并通过改变溶氧及添加辅酶NADPH对关键节点进行验证.结果表明:6–磷酸葡萄糖和丙酮酸是影响碳源流向尸胺合成的关键节点,增强磷酸戊糖途径(HMP)和三羧酸循环(TCA)可以弱化由6–磷酸葡萄糖生成6–磷酸果糖和由丙酮酸生成乳酸,促进碳源向合成尸胺的方向流动,从而有效地提高尸胺产量(产量增幅为77.8%).该研究为高产尸胺的谷氨酸棒杆菌工程菌种改造以及发酵控制提供了理论基础.     

不同原料配比对谷氨酸棒杆菌ZL9601菌株产赖氨酸的影响

以正交试验法研究分析了不同原料配比对谷氨酸棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉ－ｃｉｕｍ）ＺＬ９６０１菌株产赖氨酸的影响,通过摇瓶培养初步确定了以糖蜜为主要发酵原料生产赖氨酸的培养基最佳配比。结果表明,糖蜜２０％,豆饼水解液１．０％,玉米浆０．６％,在一定发酵条件下（ｐＨ７．０,温度３０℃）可获得较高的产量,平均产酸为６．１％。     

利用透明颤菌血红蛋白基因在谷氨酸棒杆菌中的表达提高谷氨酸和谷氨酰胺的产量

为了降低谷氨酰胺(glutamine,Gln)生产过程中所需要的高溶氧水平对设备的要求,在谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 14067中表达增强摄氧的透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb),以此提高细胞的摄氧能力及能量的供给水平.对得到的重组菌和野生菌进行了发酵实验.在溶氧只有5%的条件下,重组菌比野生菌细胞干重提高了1.2倍,单位细胞谷氨酸的生产能力提高了6.5倍,单位细胞谷氨酰胺的生产能力提高了1.4倍.对比结果显示,含有vgb基因的重组菌比野生菌在细胞生长、谷氨酸和谷氨酰胺合成等方面的能力都有显著提高.     

谷氨酸棒杆菌串联生产氨基酸和有机酸的发酵工艺

为进一步提高谷氨酸棒杆菌在工业生产中的利用效率,根据其好氧环境下可发酵生产氨基酸,厌氧条件下可积累有机酸的特性,建立了好氧、厌氧两阶段生产氨基酸及有机酸的串联发酵工艺。研究表明:在好氧条件下谷氨酸棒杆菌以80 g/L葡萄糖为碳源生产L-鸟氨酸15 g/L,糖酸转化率为18.75%;好氧发酵结束后收集菌体转入厌氧发酵工艺,以40 g/L葡萄糖为碳源,发酵液中积累乳酸19.58 g/L、乙酸1.34 g/L、丁二酸18.37 g/L,综合糖酸转化率达到98.88%。整个串联发酵工艺的实现,有效地利用了生物质资源、降低了生产能耗、减小了环境污染,有助于提高整体的经济效益,同时也为后续利用代谢工程进一步改造谷氨酸棒杆菌,并将其应用于更广泛的氨基酸、有机酸联合生产奠定了基础。     

钝齿棒杆菌YL_1基因文库的建立及异亮氨酸基因在大肠杆菌中的克隆表达

以ｐＵＣ１９质粒为载体建立了异亮氨酸产生菌钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｍｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）ＹＬｌ的基因文库，并通过酶切重组子、斑点杂交得到证实．共筛选５８００个重组子，一个特定ＤＮＡ片断在库中存在的可靠性达９９．９９％．从中克隆重组了带有ｉｌｖＡ基因片断的重组质粒ｐＹＩ９４，转化ＡＨＶ的大肠杆菌ＥＤ８６５４－５，使本来不产Ｉｌｅ的大肠杆菌可以积累Ｉｌｅ１．５ｇ／Ｌ，为进一步高效表达构建工程菌创造了条件．     

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的定点突变及其酶学性质研究

以已知晶体结构的Pseudomonas mesoacidophila MX-45菌株海藻酮糖合成酶（MutB）的晶体结构为模板,在SWISS-MODEL模建立谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）海藻糖合成酶的立体结构,并对初始结构作能量优化,通过氨基酸序列比对,选择TreS-glu保守区内的氨基酸R245、D247、E289、F244和保守区外的氨基酸A288进行定点突变,并对突变酶F244C、F244L、F244W、F244Y、A288G、R245X、E289X、D247N、D247E进行纯化和酶学性质研究,比较突变子对酶活性和热稳定性的影响。结果表明,R245、E289突变为其它的19个氨基酸后酶活力全部丧失,D247E和D247N也丧失酶活,F244C、F244L、F244W、F244Y和A288G的比活力分别降低到TreS-glu的38%、24%、62%、64%和35%,A288突变成T288后没有酶活。与TreS-glu相比,F244C、F244W、A288G的Km值基本不变,F244L、F244Y对底物麦芽糖的亲和力降低,F244Y的最适反应温度和TreS-glu相同,均为27℃,而F244C、F244L、F244W和A288G的最适温度提高到32℃。与TreS-glu相比,突变酶的最适反应pH值均有所下降,其中F244C、F244Y和A288G的为7.5,比TreS-glu的8.0均下降了约0.5个单位,而F244L和F244W的为6.5,比TreS-glu的8.0均下降了近1.5个单位。与TreS-glu相比,突变酶的热稳定性均有不同程度提高,其中F244Y、F244W和A288G的Tm值比TreS-glu的提高约1℃,F244L提高约2℃,F244C提高了近4℃。     

维生素对微生物絮凝剂REA-11合成的影响

考察了生物素、维生素B1、维生素B12等维生素对谷氨酸棒杆菌生长及生物絮凝剂合成的影响.结果表明,培养基中添加生物素对菌体的生长无明显影响,0.2 mg/L的生物素对絮凝剂的合成有一定的促进作用;维生素B1对菌体的生长有轻微的促进作用,但对絮凝剂的合成无明显影响;维生素B12对菌体的生长有一定的促进作用,0.1 mg/L的维生素B12对絮凝剂的合成有轻微的促进作用,随着维生素B12浓度的增加开始对絮凝剂的合成产生抑制作用.     

热能与动力工程专业实验教学体系改革与实践

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CICC20887为生产菌株,采用单因素实验研究了发酵工艺条件对L-缬氨酸产量的影响.结果表明,该菌发酵生产L-缬氨酸的适宜初糖浓度、生物素添加量、VB1添加量、玉米浆添加量分别为90g/L、80μg/L、0.20mg/L、30g/L,发酵期间,24h前pH值应控制在6.5～6.7、后48h应控制在7.0～7.2,温度30～31℃,发酵周期应控制在66～72h.     

棒状杆菌亮氨酸操縱子在大肠杆菌中的克隆和表达

以质粒pTZ22为载体,用HindШ限制酶切割谷氨酸棒状杆菌染色体DNA进行克隆。分离到带有亮氨酸操纵子的4.5kb片段。用Southern切口移位分子杂交检测,证明在4.5kb的片段中既包含有leuB基因,而且对leuA基因也表现同源性。     

固定化谷氨酸棒杆菌T6-13细胞生产L-谷氨酸

本文比较了海藻酸钙、明胶-戊二醛、聚丙烯酰胺和琼脂包埋法制备固定化细胞的方法。前者较后几种有较大的优越性,是一种较为理想的固定化方法.分析了海藻酸钙法国定化细胞各主要因素对酶活性的影响,确定出制备固定化细胞的最佳条件.观察凝胶珠中细胞及酶活性的变化表明,细胞在凝胶珠中生长良好,有利于谷氨酸生产.固定化细胞发酵谷氨酸的最适 pH 为7. 0～7. 5,最适温度32℃,最适转速140rpm.每批发酵96小时,糖利用率为98%,产酸量达20g/L,比常规游离细胞增加15%.     

钝齿棒杆菌AS1.542原生质体形成和再生条件的研究

本文研究了钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum AS1.542)原生质体形成和再生的条件。结果表明:菌体培养至对数生长期,用1.0 μg/ml青霉素G处理4小时,再以1000μg/ml蛋清溶菌酶在37℃下处理14小时原生质体形成率达99.0％,在含0.5M蔗糖的高渗完全基上,它的再生率为20.0～50.0％。高渗缓冲液DF比NSM和SMM更适合于原生质体的再生,高渗稳定剂0.5 mol/L蔗糖优于0.5 mol/L NaCl。用电镜观察了菌体和原生质体的形态结构。