油菜中—未知BnRCH蛋白的E3连接酶活性分析

利用本实验室前期以ATP6为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统筛选到的一个N端含有RINGv结构(RING-variant)的蛋白,暂命名为BnRCH,构建GTK-BnRCH表达载体在原核细胞E.coli BL21(DE3)中高效表达GST-BnRCH融合蛋白,并将纯化的融合蛋白加入体外泛素反应体系,发现BnRCH在ATP、泛素、E1、E2存在的条件下,能催化多聚泛素化形成,具有E3连接酶活性.     

油菜BnRCH基因提高转基因拟南芥的耐盐性研究

为探索本实验室从甘蓝型油菜中克隆到的BnRCH基因在植物耐盐中的作用,比较了NaCl胁迫下转基因与野生型拟南芥在萌发及幼苗生长的差异.结果表明:在100 mMNaCl处理下,BnRCH转基因拟南芥种子萌发率比野生型高3～5倍;盐胁迫后野生型拟南芥幼苗首先表现出枯萎、白化现象;除去盐胁迫后,转基因拟南芥幼苗恢复生长状况明显优于野生型.本实验结果表明BnRCH基因能够提高转基因拟南芥的耐盐性.     

拟南芥E3泛素连接酶AtARRE与ABI5相互作用分析

为了阐述AtARRE与ABA信号通路关键转录因子ABI5的作用,本研究采用原生质体瞬间表达系统探究了AtARRE蛋白的亚细胞定位,证明AtARRE蛋白定位于细胞核.随后,采用酵母双杂交和GST-Pull down技术分析了AtARRE与ABI5在体外的相互作用,证明AtARRE与ABI5在体外存在相互作用.最后,本研究采用双分子荧光互补实验进一步分析AtARRE与ABI5在体内的相互作用,结果表明共表达AtARRE与ABI5在植物体内存在相互作用.这些结果共同表明AtARRE可能参与了ABI5介导的植物对逆境的响应.     

BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究

为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SWE2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21（DE3）表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化人大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Westernblot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

长爪沙鼠CST3序列同源性分析及蛋白体外表达

目的 分析长爪沙鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (Cystatin C,CST3)cDNA序列同源性,并建立CST3蛋白原核表达体系,为长爪沙鼠CST3抗体制备和后续基因功能研究奠定基础。方法 对长爪沙鼠Cst3 cDNA序列进行克隆、同源性分析及密码子优化;将优化后序列酶切连接到pET28a载体,完成重组CST3蛋白表达载体构建;将该载体转化到感受态细胞中,通过异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导实现CST3蛋白的原核表达,并用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证。结果 长爪沙鼠Cst3基因与人和小鼠Cst3基因的序列同源性较低。密码子优化后的长爪沙鼠Cst3表达序列插入到pET28a质粒中,获得了CST3蛋白表达载体。经1 mmol/L IPTG 37 ℃诱导12 h,可获得大量CST3蛋白。结论 成功地构建了长爪沙鼠CST3蛋白的体外表达体系。     

甘蓝型油菜基因BnRCH转染人HEK293A和Hela细胞的研究

本研究从植物基因在动物细胞异源表达的角度入手,采用外源基因稳定转染的方法,向人胚胎肾细胞HEK 293A和人宫颈癌细胞Hela导入了BnRCH基因,获得了HEK 293A和Hela细胞的稳定转染子.使用RTPCR、qPCR和Western blot等方法鉴定了获得的稳定转染子,确认了稳定转染子的成功建立.本研究一方面说明BnRCH虽然为植物基因,却仍然能够在动物细胞中正常表达;另一方面也为开展对BnRCH基因在动物细胞中的功能研究和应用开发建立了平台.同时,使用免疫细胞化学法和绿色荧光蛋白质     

过表达E3泛素连接酶ABRv1通过泛素化CPK3提高拟南芥干旱耐受

拟南芥基因ABRv1编码了一个E3泛素连接酶,其表达量受到干旱胁迫的诱导.为了探究ABRv1功能,我们构建了ABRv1的过表达株系并进行干旱处理,结果显示ABRv1过表达株系OE-3具有90.4%的存活率,ABRv1过表达株系OE-7有88.2%的存活率,野生型Col的存活率则为53.8%,而abrv1突变体仅有7.7%的存活率,说明过表达ABRv1提高了拟南芥对干旱的耐受能力.我们还测定了干旱处理下的失水率,也能得出与上述一致的结论.此外,我们使用纯化的GSTABRv1、His-CPK3蛋白进行了体外pull-down实验和体外泛素化实验,结果证明ABRv1能够和CPK3发生相互作用,ABRv1具有E3泛素连接酶活性并且能够把CPK3单泛素化.结果揭示了ABRv1作为一个正调控因子通过泛素化作用底物CPK3参与了拟南芥的干旱胁迫应答过程.     

抑制Cullin-RING E3泛素连接酶导致片状内质网扩张

内质网(endoplasmic reticulum, ER)是细胞中一个重要的细胞器,分为片状内质网(sheet ER),和管状内质网(tubular ER),但是片状内质网的形成机制目前仍不完善.MLN4924是一种小分子药物,能抑制cullin-RING E3泛素连接酶活性并导致癌细胞凋亡.本研究发现MLN4924能使细胞中片状内质网扩张,但是片状内质网标志蛋白Climp63和成管蛋白REEP5/DP1的表达量均没有发生变化.此外,MLN4924并不能诱导内质网应激反应.最后,通过F-box siRNA文库的筛选,发现FBXO3、FBXO8、FBXO18、FBXO36、FBXO38、FBXO39、FBXL4、FBXL5、FBXL8和FBXW1与片状内质网扩张相关.这能为今后解析片状内质网的形成机制提供新的 方向和思路.     

拟南芥AtHHR3响应热胁迫应答的初步分析

拟南芥基因AtHHR3编码一个RING结构域的E3连接酶,通过生物信息学分析发现其可能参与植物热胁迫相关的应答.为了探索其具体的功能,构建了AtHHR3互补株系,并在DNA水平和转录水平分别鉴定了AtHHR3互补株系,用RT-PCR技术分析了AtHHR3在热处理条件下基因表达的变化情况.在热胁迫下分析了野生型、突变体athhr3、回复株系幼苗存活以及种子萌发的表型变化情况,发现突变体athhr3表现出对热胁迫的耐受性,并检测了热胁迫下不同株系的HSF、HSP等热相关基因的转录水平的变化,初步的研究表明拟南芥基因AtHHR3负调控植物对热胁迫的耐受性.     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

风疹病毒E1抗原基因片段的拼接及原核表达

应用基因克隆技术,对风疹病毒E1抗原基因片段进行拼接及克隆表达．根据软件GOLDKEY预测E1抗原的主要抗原决定簇位点E1(243～286aa),再设计4条近60个碱基长引物,利用PCR仪延伸合成目的基因,酶切并构建重组表达载体,酶切与测序鉴定,再转化表达菌株BL21(pLYS),IPTG诱导表达,行SDS-PAGE检测到目的基因表达成功．结果实现了用基因克隆技术将含E1(243～286)片段的pETKDO载体向大肠杆菌的转化,IPTG诱导2h,获得的表达量高。     

重组盐藻14-3-3蛋白基因的原核表达及分离纯化

根据克隆的杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因.经原核表达、Ni2+亲和层析法纯化,免疫动物制备抗体. 抗体蛋白质印迹分析检测结果表明抗体能特异结合盐藻细胞分子量为29 kD的多肽.     

拟南芥 AtTR1 在盐胁迫应答中的功能初探

本研究主要探索油菜中E3泛素连接酶BnTR1在拟南芥中的同源基因AtTR1(At3g47550)的功能.通过体外泛素化实验证明AtTR1具有E3连接酶活性.基因表达分析显示该基因受200mmol/L NaCl显著诱导,说明该基因可能在响应盐胁迫中发挥一定的功能.为了更深入的探究该基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pZH01-AtTR1转化突变体.在含有潮霉素的培养基上筛选阳性苗,并利用荧光定量PCR检测表明AtTR1基因已经成功转入突变体中.     

重组人源METTL3蛋白的表达与纯化

m6A受到甲基转移酶(METTL3,METTL14,WTAP等)/去甲基化酶(FTO,ALKBH5等)以及一些RNA 结合蛋白(YTHDF1/2/3, ELAVL1 等)的共同调控,在细胞内是一个动态可逆的过程 . 甲基化转移酶METTL3 是甲基转移酶复合物中重要的组成部分,参与调控真核生物mRNA的甲基化水平.目前关于METTL3的分子结构基础以及整个甲基化转移酶的复合物的组装机制还不是很清楚.本研究中构建了原核表达载体pET.32M.3C-METTL3 ^(1-305) ,利用大肠杆菌原核表达系统表达出了可溶性的目的蛋白,通过镍柱亲和层析,凝胶过滤层析以及离子交换层析获得了纯度高,构象均一的蛋白METTL3 ^(1-305) .除此以外,还分别利用超速离心和圆二色谱的技术对蛋白的构象以及二级结构进行了分析.已获得的高纯度融合蛋白METTL3 ^(1-305) ,为进一步研究METTL3蛋白的结构以及与复合体其他成分之间的相互作用提供了一定的基础.     

E3泛素连接酶Pellino蛋白的研究进展

Pellino蛋白是近年来新发现的一类E3泛素连接酶,通过靶蛋白泛素化介导蛋白降解、蛋白与蛋白的相互作用、蛋白质细胞定位以及信号传导.目前研究表明Pellino蛋白在固有免疫细胞和获得性免疫细胞中具有重要调控作用,与炎症和自身免疫密切相关.本文总结了近年来Pellino蛋白的表达与活性调控、介导的信号转导途径以及在免疫...     

RNA内切酶CPSF3受E3D泛素连接酶UBE3D调控

泛素化是泛素分子在系列特殊酶作用下,对靶蛋白进行特异性修饰的过程,该过程参与细胞周期、基因表达、信号传递等几乎一切生命活动的调控,近年来成为开发新药物的新靶点.泛素化研究中,确定E3泛素连接酶和其特异性底物之间的作用是研究的重点和难点,探索底物蛋白翻译后修饰命运,对于研究E3泛素酶的修饰类型具有指示性的作用.E3D泛素...     

重组小鼠14-3-3蛋白theta亚型的构建

目的 克隆编码14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,制备该蛋白质的基因重组蛋白质.方法 参照小鼠14-3-3蛋白质θ亚型mRNA结构设计引物,以小鼠脑总RNA为模板,RT-PCR法克隆编码14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,插入原核表达质粒pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)使其表达谷胱甘肽S转移酶(GST)为标签的融合蛋白质,以凝血酶定点分解融合蛋白并采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化目的 蛋白.结果 RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离可见约800 bp条带,序列分析表明重组质粒pGEX-1433theta中的插入子为738 bp,编码245个氨基酸,其核苷酸及氨基酸序列与Pubmed NM-011739展示的结果一致.重组质粒pGEX-1433theta在BL21(DE3)中的表达量随IPTG诱导时间递增,融合蛋白质为可溶性组分.亲和层析纯化的14-3-3theta在SDS-PAGE上表现为单一条带,表观相对分子质量为30 ku.每L培养菌液可收获4mg基因重组型小鼠14-3-3theta.结论 克隆了编码小鼠14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,制备了高纯度基因重组型小鼠14-3-3theta,为进行单克隆抗体的制备奠定了坚实的基础.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

石油亚砜中PSO3D,PSO3E的极性与萃取Au^3＋的性 ...

研究了石油亚砜其中２个组分ＰＳＯ３Ｄ，ＰＳＯ３Ｅ萃取Ａｕ＾３＋的性能。实验表明：在实验条件下，极性较小的亚砜的萃取Ａｕ＾３＋（盐酸介质）能力大于极性大的亚砜；亚砜硫质量分数低，分子量较大的亚砜，其萃金的萃取率越大。