内切葡聚糖酶基因克隆和表达研究进展

纤维素酶包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,它在能源、纺织、饲料、食品和造纸等行业具有重要的应用。对内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌、酵母和丝状真菌中的克隆和表达进行概述,为内切葡聚糖酶基因工程菌的构建和内切葡聚糖酶的应用提供理论依据。     

灵芝菌液态发酵富硒大豆过程中酶活性的研究

以富硒大豆豆乳为培养基,接种灵芝菌种进行发酵,对发酵过程中的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、淀粉酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力变化趋势进行研究.结果表明,在0～132 h范围内,酸性蛋白酶、淀粉酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力呈增加趋势,发酵至132 h,酸性蛋白酶、淀粉酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力达最大值,分别为9.87、0.87、0.951、.07、1.85 U/mL,中性蛋白酶活力在发酵108 h达最大值5.35 U/mL.     

液态混合菌发酵优化纤维素酶组分

在里氏木霉和黑曲霉液态混合条件下培养纤维素酶,分析两个菌种的接种比和延迟黑曲霉的接种时间对产酶的影响,探讨两个菌种发挥协同作用的最佳条件。结果表明:黑曲霉延迟接种48 h及里氏木霉与黑曲霉接种质量比1∶1时,所产纤维素酶的滤纸酶活为1.163μmol/(min.mL);β-葡萄糖苷酶活为0.606μmol/(min.mL),β-葡萄糖苷酶活与滤纸酶活比值为0.521,比单一里氏木霉产纤维素酶的酶活高,并在后续的酶解效果对比中表现最佳。48 h时的酶解得率为65.61%,高于里氏木霉单一培养时所产纤维素酶的得率53.91%和商品纤维素酶的得率49.64%。说明通过混合发酵,纤维素酶的组分得到了优化。     

瑞氏木霉内切-β-1,4葡聚糖酶基因Egl1的分子改造

为了提高瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶活力,用分子改造的方法改造其内切-β-1,4葡聚糖酶基因Egl 1.用DNase I消化EglL 1,回收50～200bp的片段,用T4 DNA连接酶连接回收的片段,进行PCR反应,将PCR产物转入瑞氏木霉原生质体,用比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力...     

纤维素酶液中β-葡萄糖苷酶的分离纯化

通过(NH4)2SO4分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting脱盐柱、Source15Q阴离子交换柱、Source 15 S阳离子交换柱、HiTrap 16/60 Sephacryl S 200 HR凝胶过滤等技术,分离纯化3种来源里氏木霉、黑曲霉、里氏木霉与黑曲霉混合纤维素酶液中的β-葡萄糖苷酶。结果表明,经SDS PAGE电泳鉴定均为电泳纯,测得黑氏木霉、黑曲霉单独培养β-葡萄糖苷酶相对分子质量分别为68、129 ku,而混合菌培养分离得到两种β-葡萄糖苷酶分子质量大小分别为66.2、134 ku。与单独培养的β-葡萄糖苷酶相似。3种来源的β-葡萄糖苷酶经多步分离纯化后的纯化倍数分别为37.25、40.21、30.12,酶活回收率分别为20.1 2%、23.21 %、28.56 %。     

内切葡聚糖酶的纯化及其基本性质

纤维素酶是自然界碳素循环中的一种关键酶,它可以将纤维素性材料,转化为可直接利用的葡萄糖,并可通过其它酶和酶系统的作用转化为乙醇及蛋白质。纤维素酶是多酶体系,包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(Cx)及β-葡萄糖苷酶。其中内切葡聚糖酶含有若干种同工酶,能将可溶性纤维素转化为还原寡糖,是纤维素酶系中的重要组分,为了深入研究Cx酶的性质,本文对其中一种Cx酶进行了分离纯化,并对其基本性质进行了研究。 1实验部分     

瑞氏木霉纤维素酶研究进展

瑞氏木霉(Trichoderma reesei)产生的纤维素酶酶系全、能分泌到细胞外,是研究得最清楚的产纤维素酶的模式菌株,但是其产生的纤维素酶还不能满足工业化转化纤维素的需要。本文从纤维素酶种类与调控、提高纤维素酶活的方法、标记基因的选择等方面概述瑞氏木霉纤维素酶,分析瑞氏木霉纤维酶研究面临的问题及对策,指出提高β?葡萄糖苷酶的产量和酶活是未来研究工作的重点之一。     

里氏木霉纤维素酶系的分离及其酶学性质

采用两级超滤、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、CM-Sepharose FF阳离子交换层析和Sephadex G-100凝胶渗透层析等分级纯化步骤,从里氏木霉纤维素酶系中分离纯化得到电泳纯的3个内切葡聚糖酶组分EGⅠ、EGⅡ和EGⅢ,2个外切葡聚糖酶组分CBHⅠ和CBHⅡ和1个β-葡萄糖苷酶组分,它们对各自底物的比活力分别为176.35、153.96、64.22、16.86、4.82、31.00 IU/mg,米氏常数分别为6.70、8.46、13.22、1.37、3.46、2.20 mg/mL.同一类酶组分的米氏常数Km越大,转换数Kcat越小.分离纯化所得EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、CBHⅠ、CBHⅡ和GB等酶组分的分子量分别为50、46、25、65、58、75 kDa.     

里氏木霉几丁质酶基因的克隆及其同源转化研究

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)外切几丁质酶具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性.根据里氏木霉基因组数据库获得了一个编号为21725的外切几丁质酶nagl基因序列,根据检索结果,从里氏木霉QM9414基因组DNA中克隆获得1.9kb的基因片段.构建了以cbhl为启动子和终止子的重组质粒pCbhNag,与含有pyr4基因的质粒pSKpyr4共转化里氏木霉pyr4缺陷株RutC30△U3.共得到99个转化子,初筛得到5株乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活较高的转化子,其中N3菌株的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活可达26.65 U/mL,而出发菌株的胞外几丁质酶几乎无酶活.成功实现了里氏木霉几丁质酶的克隆及同源表达.     

瑞氏木霉β-内切葡聚糖酶的纯化及其部分酶学性质研究

 利用盐析、SephadexG-75和DEAE-SephadexA50层析,从瑞氏木霉TrichodermareeseiQM9414发酵液中纯化了2个具有β-内切葡聚糖酶活性的组分Eg1和Eg2,分子质量分别为65.47ku和57.04ku.其最适温度分别为50℃和55℃,最适pH分别为4.8和5.0,米氏常数Km分别为3.76×10^-2g/L和4.20×10^-2g/L.根据其酶学性质,这是一类不同于已有的β-内切葡聚糖酶,为瑞氏木霉T.reeseiQM9414所产β-内切葡聚糖酶的进一步研究奠定了基础.