拟南芥RING finger结构域ABRv1基因的功能初步研究

拟南芥ABscisic acid responsive RING-v protein 1基因（ABRv1）编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶。为了分析ABRv1的基因功能,我们首先构建了高表达载体pBI121- ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1。通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T –DNA插入突变体abrv1。对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,检测其萌发率、气孔关闭情况进行,发现ABA处理后突变体的萌发率降低,过表达株系萌发率升高;突变体株系气孔几乎未关闭,过表达株系气孔关闭非常明显。以上结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用,为深入分析该基因的功能打下基础。     

番茄SlSL1重组蛋白的表达、纯化及体外泛素化活性检测

泛素化作为真核生物细胞内普遍存在且极为关键的蛋白质翻译后修饰,可以使被修饰的蛋白质发生降解,在植物生长发育、胁迫应答等方面发挥着重要作用。泛素化降解需要通过E3泛素连接酶特异性识别靶蛋白并对其进行修饰,因此E3连接酶在泛素化途径中起着决定性的作用。文章通过克隆番茄SlSL1基因编码序列、构建原核重组表达质粒,并利用诱导表达、亲和吸附纯化SlSL1重组蛋白,以此进行SlSL1的体外泛素化活性检测。SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,由所构建番茄SlSL1基因重组质粒纯化获得SlSL1蛋白;体外泛素化检测显示,SlSL1蛋白形成多聚化泛素条带,具有E3泛素连接酶活性,表明SlSL1可能在番茄的泛素化调控途径中发挥功能。     

拟南芥锌指结构域ABRv1基因的功能研究

为了分析拟南芥脱落酸响应蛋白RING-V1基因(ABRv1)的功能,构建了高表达载体pBI121-ABRv1,经农杆菌转化,花序浸染后得到T0代转基因种子,并经卡那霉素板筛选得到转基因苗,再经过两代的筛选获取了纯合的高表达株系ABRv1.通过DNA及RNA水平鉴定了ABRv1基因的T-DNA插入突变体abrv1.对突变体、高表达转基因株系及野生型进行ABA诱导处理,突变体的萌发率不足10%,野生型萌发率为40%,而过表达株系萌发率为67%;突变体株系气孔几乎全部关闭,过表达株系气孔关闭不明显,大小是突变体株系的2~3倍.结果表明ABRv1基因在拟南芥的ABA信号应答响应中可能起负调控作用.     

拟南芥AtTR1对AtCPK28和AtCPK32的体外泛素化修饰研究

为了研究E3连接酶AtTR1和非生物胁迫应答的相关蛋白AtCPK28、AtCPK32之间关系,本文构建原核表达载体pET28a-AtCPK28和pET28a-AtCPK32,并在大肠杆菌中表达了AtTR1、AtCPK28和AtCPK32重组蛋白,利用亲和层析纯化相应融合蛋白.将AtCPK28和AtCPK32蛋白分别加入含有ATP、泛素、E1、E2和AtTR1的体外泛素反应体系中,western blot检测到AtCPK28和AtCPK32有多聚泛素化条带,说明AtTR1在体外能多泛素化修饰AtCPK28和AtCPK32.结果表明AtCPK28和AtCPK32可能是AtTR1调控植物抗逆信号中的下游靶蛋白.     

提高番茄品质的番茄去泛素化酶基因AMSH3

AMSH3酶是去泛素化酶中MPN(+)/JAMM蛋白酶家族的一员,能结合泛素化蛋白上的泛素分子。文章在番茄中发现了一去泛素化酶基因SlAMSH3,与拟南芥去泛素化酶基因AtAMSH3在核酸水平和蛋白水平分别有81%和71%的相似性。拟南芥中去泛素化酶AtAMSH3会影响植物液泡的形成和液泡蛋白的运输途径。文章构建了SlAMSH3果实特异表达的过表达载体,并通过根瘤农杆菌介导转化到野生型番茄中,通过筛选获得SlAMSH3在果实中高表达阳性株系,实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分析显示,转基因番茄果实中SlAMSH3的表达量明显高于野生型果实(p0.05)。文章测定了阳性番茄株系绿熟期果实叶绿素质量浓度及红熟期果实的单果质量、果实糖度、果实硬度、番茄红素质量浓度和β-胡萝卜素质量浓度。结果表明,转基因番茄果实的叶绿素总质量浓度、番茄红素和β-胡萝卜素比野生型分别提高178.61%、40.53%和74.86%,其他指标无显著差异。因此,SlAMSH3果实特异过表达的方法能够改良番茄果实品质,为基因工程方法改良番茄果实品质做出了新尝试。     

RNA内切酶CPSF3受E3D泛素连接酶UBE3D调控

泛素化是泛素分子在系列特殊酶作用下,对靶蛋白进行特异性修饰的过程,该过程参与细胞周期、基因表达、信号传递等几乎一切生命活动的调控,近年来成为开发新药物的新靶点.泛素化研究中,确定E3泛素连接酶和其特异性底物之间的作用是研究的重点和难点,探索底物蛋白翻译后修饰命运,对于研究E3泛素酶的修饰类型具有指示性的作用.E3D泛素...     

水稻组蛋白单泛素化连接酶基因(OsHUB1)的克隆及其表达分析

对模式植物拟南芥的研究发现,AtHUB1基因参与调控植物对灰霉病的抗性.为了研究水稻的抗病机理,笔者利用同源搜索从水稻数据库中获得了目标基因的序列,并通过RT-PCR技术从水稻中克隆了组蛋白单泛素化连接酶基因,命名为OsHUB1.该片段包含1个2 655 bp的开放阅读框,编码了1个885氨基酸的多肽.与NCBI数据库的比对结果表明:OsHUB1的氨基酸序列与短柄草(Brachypodium distachyon)、葡萄(Vitis vinifera)、杨树(Populus tomentosa)、大豆(Glycine max)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的泛素E3连接酶的同源性分别为78%,68%,68%,67%和62%.这些不同来源的组蛋白单泛素化连接酶都含有一个高度保守的RING指结构域.半定量表达分析结果表明:OsHUB1基因能够被水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)诱导表达,说明OsHUB1基因可能通过SA和JA介导的信号转导途径参与水稻的抗病反应.     

拟南芥AtRAC在盐胁迫应答中的功能研究

本实验所研究的拟南芥AtRAC含有两个RING结构域和三个蛋白激酶C保守区域1结构域即C1结构域.通过体外泛素化证明了AtRAC具有E3连接酶活性,亚细胞定位实验结果表明AtRAC定位在细胞核中.组织特异性分析表明AtRAC在根中的表达量很高,但是在茎、叶和花中的表达量较低,而且AtRAC的表达受到NaCl胁迫的诱导.进一步对atrac突变体的分析表明,在NaCl处理下,突变体atrac的萌发率降低,侧根数目也降低.初步研究表明拟南芥AtRAC可能是一个与盐胁迫应答相关的基因.     

拟南芥 AtTR1 在盐胁迫应答中的功能初探

本研究主要探索油菜中E3泛素连接酶BnTR1在拟南芥中的同源基因AtTR1(At3g47550)的功能.通过体外泛素化实验证明AtTR1具有E3连接酶活性.基因表达分析显示该基因受200mmol/L NaCl显著诱导,说明该基因可能在响应盐胁迫中发挥一定的功能.为了更深入的探究该基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pZH01-AtTR1转化突变体.在含有潮霉素的培养基上筛选阳性苗,并利用荧光定量PCR检测表明AtTR1基因已经成功转入突变体中.     

拟南芥RING finger结构域AtHHR1基因的功能初步研究

为了研究拟南芥基因AtHHR1(编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶)是否参与热胁迫响应,构建了athhr1/AtHHR1互补转基因株系.对突变体、互补株系及野生型进行热胁迫处理,发现突变体的萌发率、叶绿素及脯氨酸含量高于野生型,而互补株系均低于野生型.通过real-time PCR定量检测发现,热诱导后拟南芥热信号通路中相关热激蛋白基因在突变体中表达比野生型中高.研究结果初步表明AtHHR1基因在拟南芥的热胁迫响应中起负调控作用.     

拟南芥AtHHR3响应热胁迫应答的初步分析

拟南芥基因AtHHR3编码一个RING结构域的E3连接酶,通过生物信息学分析发现其可能参与植物热胁迫相关的应答.为了探索其具体的功能,构建了AtHHR3互补株系,并在DNA水平和转录水平分别鉴定了AtHHR3互补株系,用RT-PCR技术分析了AtHHR3在热处理条件下基因表达的变化情况.在热胁迫下分析了野生型、突变体athhr3、回复株系幼苗存活以及种子萌发的表型变化情况,发现突变体athhr3表现出对热胁迫的耐受性,并检测了热胁迫下不同株系的HSF、HSP等热相关基因的转录水平的变化,初步的研究表明拟南芥基因AtHHR3负调控植物对热胁迫的耐受性.     

AhBG1转基因拟南芥的ABA敏感性和抗旱性研究

为探究花生基因AhBG1对拟南芥ABA敏感性和抗旱性的影响,以过表达AhBG1拟南芥为材料,检测其ABA敏感性及脱水处理下ABA质量分数、叶片失水率、干旱存活率及ABA稳态相关基因表达变化.结果表明:AhBG1是编码花生β-葡萄糖苷酶的家族成员,定位于细胞质;与野生型相比,AhBG1过表达拟南芥植株在干旱条件下体内AB...     

超表达GLDH拟南芥植株对高光胁迫的响应

以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为实验材料，研究了在短时间高光胁迫下两种基因型植株（GLDH基因超表达植株gldh236OE和哥伦比亚野生型Col）的表型、叶绿素含量、叶绿素荧光等生理数据的变化。结果表明，超表达植株的抗坏血酸表达量显著高于野生型，高光对超表达植株叶片的伤害也小于对照野生型；野生型植株叶片叶绿素含量在高光处理前后并无明显变化，而超表达植株的叶绿素含量显著降低；PSII有效光化学效率Yield和光合电子传递速率ETR呈明显降低趋势，对照野生型的降低程度更明显，说明高光胁迫使PSII结构与功能受到一定程度的损伤与破坏，而抗坏血酸含量的增加能在一定程度上缓解高光胁迫所带来的伤害。研究结果表明，通过基因表达调控提高抗坏血酸水平能有效缓解强光胁迫，使植物更好的适应高光，维持植物正常生理生态性状。     

拟南芥抗旱突变体的筛选和鉴定

文章采用不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫,以发芽率为筛选指标在拟南芥突变体库中筛选抗旱突变体,筛选出2株候选突变体,最终得到1株稳定突变体vem1,通过表型和生理生化鉴定,确定为抗旱突变体。该研究为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础,对于揭示植物抗旱的分子机理具有重要的理论意义。     

F-box基因FOF2在拟南芥盐和冷胁迫响应中的功能分析

FOF2为F-box蛋白家族成员,其生物学功能尚不清楚.采用实时荧光定量PCR和生理学实验相结合的方法,对FOF2基因的表达模式及其在拟南芥抗盐和冷胁迫响应中的作用进行了分析.研究发现,FOF2在拟南芥根、茎生叶和果荚中表达较高,并且其表达受盐和冷胁迫诱导.FOF2过表达株系对盐胁迫敏感,与野生型相比种子萌发率低、幼苗主根较短;相反,fof2突变体对盐胁迫的敏感性则减弱.FOF2过表达和缺失突变体种子萌发对冷胁迫无响应,但其主根在冷处理中分别比野生型短或者长.盐处理下,FOF2过表达株系中盐胁迫反应相关基因的表达量显著降低,fof2突变体中则升高;冷处理下,FOF2过表达株系中冷胁迫反应相关基因的表达量显著升高,fof2突变体中则降低.结果表明,FOF2在植物抗盐胁迫响应中起负调控作用,在抗冷胁迫响应中则可能起正调控作用.     

人参亲环素基因表达载体构建及其在拟南芥中的抗盐活性分析

摘 要 为研究人参亲还素基因的抗盐活性,为该基因在人参抗逆育种方面的应用提供参考,通过植物转基因技术和外施不同浓度NaCl的方法获得阳性拟南芥植株,研究了不同植株类型不同盐浓度下的种子萌发率、植株生存率、植株主根长、植株分支数等相关指标。结果表明：在盐胁迫作用下转基因拟南芥种子萌发率高于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株生存率显著高于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株主根长大于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株分支数与野生型拟南芥植株分支数没有明显差异。可见人参亲还素基因提高了转基因拟南芥抵御高盐胁迫的能力。     

异源表达花生基因AhGLK1对拟南芥glk1glk2突变体表型特征及抗旱性的影响

为探讨花生基因AhGLK1对拟南芥表型特征和抗旱能力的影响,以glk1glk2突变体为实验材料,异源表达AhGLK1,观察转基因拟南芥表型特征,包括叶色、叶片数量和形态等;利用共聚焦显微镜观察叶绿体;测定拟南芥叶片失水率和旱后存活率;利用荧光测定仪检测干旱和复水恢复过程中,拟南芥叶片叶绿素荧光参数的变化.结果表明:AhGLK1/glk1glk2回复株系拟南芥叶片呈绿色,叶片数量增加,叶片卷曲,叶柄增长,叶绿体发育完善,气孔增多,叶片保水性提高,旱后存活率显著升高.叶绿素荧光参数在干旱胁迫下显著降低,而复水时恢复.证明AhGLK1通过影响叶片数量、形态发育以及光合作用等提高拟南芥的抗旱能力.     

Characterization of Arabidopsis calreticulin mutants in response to calcium and salinity stresses

As an important calcium-binding protein, calreticulin plays an important role in regulating calcium homeostasis in endoplasmic reticulum （ER） of plants. Here, we identified three loss-of-function mutants of calreticulin genes in Arabidopsis to demonstrate the function of calreticulin in response to calcium and salinity stresses. There are three genes encoding calreticulin in Arabidopsis, and they are named AtCRT1, 2, and 3, respectively. We found that both single mutant of crt3 and double mutant of crtl crt2 were more sensitive to low calcium environment than wild-type Arabidopsis. Moreover, crt3 mutant showed more sensitivity to salt treatment at germination stage, but tolerance to salt stress at later stage compared with wild-type plant. However, there was no obvious growth difference in the mutant crtl and crt2 compared with wild-type Arabidopsis under calcium and salt stresses. These results suggest that calreticulin functions in plant responses to calcium and salt stresses.