克隆与序列分析中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）HSP70基因全长ORF的RACE

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Edocheirsinensis)的Hsp70基因并进行序列分析.以中华绒螯蟹卵组织cDNA为模板,克隆测序后拼接得到一条长2 429 bp的cDNA序列,序列分析表明其覆盖了完整编码区,编码649个氨基酸.经antheprot分析发现2个Hsp70基因的签名序列:IFDLGGGTFDVSIL,IVLVGGSTRIPKIQK;Dnak特征基序DLGTF-S-V;非细胞器基序:RARFEEL;核定位信号标签:KKDPSESKRALRRL;胞质Hsp70特征基序GPTIEEVD.经BLASTn和BLASTx软件分析,该编码区核苷酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus uannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)的相似性分别为85.30%和84.89%.根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的相似性分别为93.23%和93.40%.本研究克隆了中华绒螯蟹的Hsp70基因,为进一步深入研究锯缘青蟹的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础.     

凡纳滨对虾线粒体DNA COI基因片段序列

以相应引物对凡纳滨对虾（Lito penaeus vannamei）线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因（mtDNA CO I）进行PCR扩增，经过基因重组、转化、克隆、筛选、DNA测序，得到709bp的碱基片段．碱基组成A、C、G、T含量分别为198bp（27．93％）、136bp（19．18％）、129bp（18．19％）、246bp（34．70％）．与果蝇（Drosophilayakuba）的mtDNA CO I全序列比对。经分析发现：本实验获得的凡纳滨对虾mt CO I基因片段序列和Gen Bank上的同种序列（AY264901）都只是基因序列的一部分，二者之间有41bp的重叠并可拼接，拼接后的总长为1515bp．证明本实验条件下获得的mtCO I基因片段确实来自凡纳滨对虾线粒体DNA，且本实验所用引物具有通用性．     

中国明对虾卵黄蛋白原部分cDNA序列和表达部位研究

从成熟的中国明对虾卵巢中提取总RNA,经同源克隆得到了卵黄蛋白原(Vg)部分cDNA序列,长度为1 226 bp。在NCBI上比对后发现它与墨吉明对虾、短沟对虾等的Vg mRNA序列有很高的相似性。根据8种虾(墨吉明对虾、短沟对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾、刀额新对虾、罗氏沼虾、高背长额虾和中国明对虾)Vg mRNA相应序列建立了系统发生树。通过RT-PCR证实了雌虾的卵巢和肝胰腺是卵黄蛋白原的合成位点。     

日本囊对虾线粒体DNA CO I基因片段序列分析

以相应引物对日本囊对虾（Marsupenaeus ja ponicus）线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因（mtDNACO1）进行PCR扩增．经过基因重组、转化、克隆、筛选、DNA测序。得到709bp的碱基片断．碱基组成A、C、G、T含量分别为196bp（27．64％）、129bp（18．19％）、134bp（18．90％）、250bp（35．26％）．与GenBank中斑节对虾（Penaeusmonodon）的mtD—NACO I全序列（AF217843）比对。经分析发现：本实验获得的日本囊对虾mtCO I基因片段序列和GenBank上的同种序列（AY264897）都只是该种COI基因序列的一部分．二者之间有4lbp的重叠并可拼接．拼接后的总长为1515bp．     

锯缘青蟹精氨酸激酶基因的克隆与表达

通过分子生物学方法,克隆得到锯缘青蟹（Scylla serrata）精氨酸激酶（Arginine Kinase,AK）开放阅读框基因序列.测序结果显示：该开放阅读框基因的序列长度为1 071 bp,编码356个氨基酸残基;该序列登录Genbank（GQ：851626）,序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶与凡纳滨对虾（...     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)ATG3基因克隆及其在WSSV感染中的表达

为了揭示凡纳滨对虾自噬相关基因LvATG3在对虾先天免疫过程中的作用,利用PCR技术克隆出LvATG3,利用荧光定量PCR方法检测LvATG3在凡纳滨对虾不同组织中的表达,用白斑综合症病毒(WSSV)侵染凡纳滨对虾,检测WSSV侵染后不同时间LvATG3的基因表达情况.LvATG3 ORF区全长948 bp,编码315...     

盐度对凡纳滨对虾、中国明对虾和斑节对虾仔虾生长和存活的影响

为开发渤海滩涂对虾养殖业,研究盐度(30‰和45‰)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和斑节对虾(Penaeus monodon)仔虾生长和存活的影响.结果表明,经过10周的室内养殖,除斑节对虾外,凡纳滨对虾和中国明对虾在不同盐度下生长无显著差异(P>0.05).凡纳滨对虾无论是在盐度30‰或45‰,其生长和成活率均显著高于中国明对虾和斑节对虾(P<0.05),表明凡纳滨对虾更适于高盐环境养殖.     

海甘蓝硫甙合成关键酶S—GT基因克隆及种子特异性hpRNAi载体构建

根据甘蓝型油菜S-GT（thiohydroximate S-glucosyltransferase）基因cDNA序列设计引物,以海甘蓝总DNA为模板进行PCR扩增,获得S-GT基因全长。克隆的海甘蓝S—GT序列与甘蓝型油菜序列相比,除74bp的内含予部分外有92个碱基的差别,相似性高达93．4％。分析显示该序列均有完整的开放阅读框,并表明所克隆的海甘蓝S-GT序列编码465个氨基酸,在第10个位点上比甘蓝型油菜序列少一个丙氨酸（A）,总共有23个氨基酸不同,相似性为95．06％。根据获得的基因序列设计引物扩增出同一基因序列相同但是带有不同酶切位点的两个片段,将两个片段反向插入到已构建的带有种子特异表达载体内含子的两端,成功构建了海甘蓝S-GT基因的种子特异性hpRNAi载体,为特异性降低海甘蓝的种子硫甙奠定了基础。     

土曲霉CCTCCAF93044植酸酶基因的克隆及序列分析

参考Hartingsvedt已发表的NRRL3135植酸酶（phyA）基因序列,设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以土曲霉CCTCCAF93044总DNA为模板,扩增出了不包括假定的信号肽序列的phyA基因,并将其克隆到PMD18－T载体上,测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列,该基因全长为1433bp,与已发表的NRRL3135的phyA基因的同源性为97％,编码一个含458个氨基物的蛋白质。     

地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

嗜麦芽黄单胞菌CG样受体跨膜域克隆与分析

根据已知生物LH/CG受体同源性较大的跨膜域序列设计引物，以嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，将约600bp目的产物克隆到pUCm-T载体上，经酶切及PCR扩增筛选鉴定得到重组质粒pUCm-Rec，以DIG标记的PCR扩增片段作为探针进行DNA斑点杂交，确证目的PCR扩增片段与该菌染色体DNA有同源性，克隆到的593bpCG样受体跨膜域序列在GenBank中的注册号为AY355346，再以地高辛标记的593bp跨膜域序列为探针，从构建的该菌基因组文库中，筛选到可能与CG样受体属于同一跨膜受体家族的编码组氨酸激酶／效应调节杂合蛋白部分序列的685bp核酸片段(其在GenBank中的注册号为AY359445)。     

小拟南芥几丁质酶基因cDNA的克隆与序列分析

通过合成1对特异引物，应用RT-PCR技术从小拟南芥总RNA中经反转录克隆出几丁质酶基因，该cDNA基因全长985bp，含有1个963bp的开放阅读框(ORF)，编码321个氨基酸，推测分子量为35．53kD，序列同源性分析表明，该基因与拟南芥几丁质酶基因有93％的同源性。     

大豆11S球蛋白基因Gy1启动子克隆及序列分析

以高蛋白大豆品种南农87C-38总DNA为模板,采用PCR法扩增获得约1100bp大小的DNA片段,回收该片段并克隆到puCm-T载体上,选取阳性克隆进行PCR和酶切检测,再进行测序分析.序列分析显示该片段含1174个核苷酸,采用Vector NTI软件将试验中克隆的序列与GenBank E07850报道的Gy1启动子和GenBank X15121报道的Gy1启动子及信号肽对应序列分别进行比对,同源性分别为99.6%和99.3%.确定该片断为南农87C-38大豆11S球蛋白基因Gy1启动子及信号肽.该启动子的成功克隆,可为今后利用基因工程技术改良大豆种子营养品质研究奠定基础.     

三株弧菌热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

 根据GenBank中同类蛋白序列设计特异PCR引物,从2株创伤弧菌Vibrio vulnificus和1株河弧菌Vibrio fluvialis中扩增出热休克蛋 白70（heat shock protein, hsp70）基因片段。对这3个片段进行克隆、测序和分析的结果表明,3个片段长均为1 911 bp,包含完整的 hsp70 ORF,编码636个氨基酸。它们的氨基酸序列与GenBank中其它物种hsp70的氨基酸序列比较发现,2株创伤弧菌hsp70基因序列 和同种其它菌株的同源性高,达98%以上;而河弧菌的hsp70序列属首次克隆;与多种原核和真核生物的hsp70氨基酸序列一起构建 了系统进化树,结果支持传统的分类结果。     

玉米候选抗病相关基因片段的克隆

根据已经克隆的植物抗病基因和候选抗病基因的保守序列P-loop、Kinase-2及GLPLAL设计一系列简并引物，利用同源序列扩增法，对玉米的基因组DNA进行PCR扩增，并对5个扩增产物的克隆进行测序．测序结果在Gen—Bank内进行BLAST检索，发现A9克隆序列与玉米BAC库中的206C17克隆的部分序列有很高的相似性，并且距离GenBank内注册的玉米抗锈病基因rpl位点中的rpl-3基因、rpl-4基因分别约有66Kb、20Kb，且A9克隆序列在玉米基因组中是单拷贝的．这为玉米抗锈病性状的分子标记辅助选择和抗锈病基因的克隆奠定了良好的基础。     

Cloning,sequencing of the HSC70 gene in Ctenopharyngodon idella

A cDNA encoding heat shock cognate protein 70(HSC70)was cloned from liver of grass carp(Ctenopharyngodon idella)(GenBank JF436930).This cDNA was found out to contain2 346 bp in length,including 1 950 bp of complete coding sequence encoding 649 amino acids(aa),plus 89 bp of 5′-UTR and 307 bp of3′-UTR.Analysis of its genomic structure revealed that its corresponding gene contained seven exons and six introns.Homology analysis indicated that it shared 99%of identity with HSC70 of breams and 86%of identity with HSP70 of Drosophila.Fluorescent RT-PCR analysis revealed that at 28℃,this gene was expressed in abdominal fat,muscle,intestines,brain,middle kidney,head kidney,gonads,swim bladder,liver,heart,spleen,gills,and fins with expression level in liver being the highest(p0.05),followed by that in the gonads;at 36℃,its mRNA expression level was increased at first but then decreased thereafter under heat shock stress,indicating that its expression can be regulated by heat shock.In conclusion,cloning and expression analysis identified a cDNA encoding a constitutive HSP70 gene that is expressed in many tissues of Ctenopharyngodon idella and its expression was down-regulated by heat shock.     

刀额新对虾周期蛋白B基因的分子克隆及序列分析

周期蛋白B(cyclin B)是真核生物细胞周期的一种重要调控原件,通过调节周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependent kinase,CKD)的活性可以控制细胞周期.运用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆了刀额新对虾(Metapendeusensis)cyclin B基因.刀额新对虾cyclin B的cDNA全长为1681 bp,5′端非编码区为111 bp,3 ′端非编码区为355 bp,开放阅读框为1215 bp,编码404个氨基酸,平均分子质量为45767.9 u,pl为8.81.Blast比对后发现,其氧摹酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)的同源性达约90％.基于cyclin B序列所绘制的进化树基本上能反映出各物种间的进化关系.半定量RT-PCR结果显示,刀额新对虾的cyclinB基因在不同组织表达中具有明显的组织特异性,在鳃、卵巢和心脏中有较高的表达量,在眼柄神经节和胸神经节中表达量较低.推测该差异性主要与cyclin B在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关.     

棉蚜Para钠通道cDNA和基因组DNA片段的克隆和序列分析

采用降落 PCR技术 ,根据昆虫 para型钠通道 区 S4至 S6及 与 连接区的保守区域设计简并引物 ,成功地克隆了棉蚜 para型钠离子通道 c DNA和基因组 DNA片段 (Gene Bank登录号分别为 :AF4 114 5 5、AF4 475 74 ) ,其中 c DNA片段为 6 5 9bp,编码 2 2 0个氨基酸。利用 c DNA片段设计特异性引物克隆获的基因组DNA片段为 132 8bp,共有 2个内含子。Blast序列分析表明 ,PCR扩增获得的棉蚜 para型钠离子通道 c DNA片段所编码的氨基酸与其他昆虫的 para型钠通道氨基酸具有很高的同源相似性 ,与马铃薯甲虫、德国小蠊、果蝇和家蝇的同源性分别为 6 5 %、6 3%、6 3%、5 9%。棉蚜 para型钠离子通道 c DNA和基因组 DNA片段的克隆对于农药分子设计与害虫抗性机制 ,特别是靶标抗性分子监测具有重要意义。