中间苍白杆菌SCUEC4菌株中尼古丁降解相关ocnC基因的克隆与表达

对中间苍白杆菌SCUEC4菌株中与尼古丁降解相关的ocnC基因进行克隆和表达,并对OcnC蛋白的表达条件进行优化,通过PCR扩增获得ocnC基因,构建重组质粒pET28a(+)-ocnC,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,采用不同的IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对OcnC蛋白进行诱导表达.结果表明:ocnC基因大小为1344 bp,编码蛋白分子量为48.0 kDa,重组表达菌株在IPTG浓度为1.0 mmol·L~(-1)、诱导温度在37℃及诱导表达时间在20 h的优化表达条件时,OcnC蛋白的表达量较高.     

人脑蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1基因克隆与原核表达

从人脑组织中提取mRNA,通过RT-PCR扩增出目标cDNA,构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1重组质粒.将重组质粒转化进E.coli TOP10感受态细胞中,筛选阳性克隆进行验证,将测序正确的质粒转化到E.coli Transetta感受态细胞中表达SHP-1.进一步对SHP-1表达的诱导温度和IPTG浓度等条件进行优化.结果显示,所克隆的SHP-1基因片断经PCR鉴定和测序分析,与目标基因完全相符.通过蛋白表达条件的优化,发现20℃,0.4mmol/L IPTG对表达菌株进行诱导时,SHP-1可溶性蛋白表达量最大.     

番茄抗白粉病必需基因ShGSTU1原核表达条件优化

采用RT-PCR技术从番茄中扩增谷光甘肽转移酶基因ShGSTU1,构建该基因的原核表达载体pET28aShGSTU1和pET32a-ShGSTU1,并对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达条件进行优化,主要对诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度进行分析.结果表明:重组蛋白在表达载体pET28a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,37℃诱导4h;在表达载体pET32a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,30℃诱导5h.     

Ⅰ型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白L基因片段的克隆及高效表达

 采用PCR方法扩增HSV-1病毒型特异性包膜糖蛋白L(gL)基因片段并克隆至原核表达载体pGEX-5X-1获得重组质粒pGEX-5X-1-gL,将重组质粒转化E.coli BL21表达菌后经IPTG诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE蛋白检测表明,在分子质量56 ku处有HSV-1 GST-gL融合蛋白的高效表达,通过IPTG浓度筛选和诱导前表达菌扩增培养时间的比较分析对诱导条件进行了优化,GST-gL融合蛋白表达量可达到菌体蛋白总量的48.65%.Western blot中利用HSV-1灭活病毒获得的多克隆抗体确证所表达蛋白为HSV-1病毒组分.这一表达系统的建立和优化对进一步探讨HSV-1 gL蛋白功能及其免疫原性提供了有利条件.     

幽门螺杆菌hpaA基因克隆及其蛋白的表达纯化

目的克隆幽门螺杆菌hpaA基因,构建hpaA-pET-32a重组质粒,并对其重组蛋白进行表达纯化,为其进一步的免疫研究提供实验基础.方法采用PCR方法,从幽门螺杆菌临床分离菌株中扩增hpaA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,通过表达载体pET-32a构建的hpaA的重组质粒,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,最后对重组蛋白进行纯化.结果重组质粒hpaA-pET-32a经双酶切、PCR及测序证明构建成功,经诱导重组蛋白成功表达,以包涵体蛋白的形式存在,对其纯化后获得了高纯度的重组蛋白.结论成功构建幽门螺杆菌hpaA的原核表达系统,并对其重组蛋白进行了表达纯化.     

嗜根考克氏菌翻译延伸因子P基因的克隆、表达及其条件优化

为获得大量可溶性重组蛋白EF-P用以构建以EF-P蛋白为靶标的新型、高效抗细菌抗生素筛选模型,研究嗜根考克氏菌DC2201 efp基因的体外克隆、表达及表达条件的优化.首先对efp基因进行生物信息学分析,随后经PCR特异性扩增获得efp基因并将其插入表达质粒pET-29a(+)中,重组质粒(pET-29a(+)-efp)转化至表达宿主菌株E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,通过优化诱导表达条件(起始菌体浓度、温度、IPTG终浓度、时间)获得大量可溶性目的蛋白,最后对表达产物进行镍离子亲和层析柱纯化及SDS-PAGE、MALDI-TOF-TOF鉴定.结果获得相对分子质量大小约为25 kDa的蛋白条带,与预测的目的重组蛋白相对分子量大小相符.选择O_(D600 nm)     

exendin-4表达载体构建及其在大肠杆菌中分泌表达

目的:研究新型抗糖尿病药物exendin-4的分子作用机制,为exendin-4的大规模生产奠定基础.方法:采用重叠PCR法扩增出exendin-4的完整序列,并将其克隆至表达载体pET22b上,得到重组质粒pET-Exn4.重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,超声破碎表达产物,Tricine-SDS-PAGE分析exendin-4表达.结果:PCR、酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pET-Exn4,Tricine-SDS-PAGE结果表明ex-endin-4基因在大肠杆菌中获得了分泌表达.结论:成功构建了exendin-4的重组表达载体并在大肠杆菌中实现分泌表达.     

hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒的构建与表达

为构建hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒,筛选其高效表达工程菌,设计特异性引物,PCR扩增目的基因并克隆至pPROEX HTb质粒Nco Ⅰ/HindⅢ位点,经双酶切及序列测定筛选阳性克隆,IPTG诱导工程菌后以SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达情况,并测定其抗原性和生物学活性,结果成功构建了工程菌Top1O F'[hIL-2/IFN-γ],经优化表达条件后,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%,分子质量约为34 ku.ELISA和Western-blot实验结果表明,目的蛋白能特异性结合抗IFN-γ抗体,呈阳性反应,生物学活性测定显示其IL-2和IFN-γ比活性分别为1.7×107U/mg与3.2×106U/mg.     

Lrrc10蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET-Lrrc10和Lrrc10蛋白表达,利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体pMD18-T-Lrrc10,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a(+),转入E.coli strainDH5α,菌落PCR筛选阳性菌落,提取阳性菌质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E.coli strain BL21(DE3),于37℃振荡培养,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrc10。转入E.coli strain BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

人TCTP基因的克隆与原核表达

人翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）是一个在进化过程中高度保守且具有很高表达量的蛋白家族。本实验通过PCR技术扩增人hTCTP基因,经酶切后插入表达质粒pGEX-4T-2构建表达载体,转化大肠杆菌后挑选阳性菌进行菌落PCR及质粒酶切鉴定,确证克隆成功并构建了人hTCTP基因表达载体。重组表达载体经IPTG诱导表达出目的蛋白,用超声破碎、亲和层析和SDS-PAGE对目的蛋白进行了分离纯化并鉴定。     

花特异表达启动子的克隆及花色调节基因Lc表达载体的构建

克隆了矮牵牛花特异表达基因CHSA启动子，并定向插入到已含有花色调节基因Lc的质粒pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子．所构建的新表达载体可用于花色改良研究．     

HIV-1外膜蛋白原核表达载体的构建与表达

为原核表达免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)外膜蛋白,对HIV-1外膜蛋白的基因进行了修饰,并利用PCR技术克隆env基因,将env基因克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达外膜蛋白,应用Western blotting检测其表达情况.结果表明:酶切鉴定证实正确地构建了pRSETB表达质粒,Western blotting和SDS-PAGE试验检测结果表明,构建后的env基因能在低温诱导的条件下表达.产物的相对分子质量为50000和33000,表达的env蛋白具有较好的免疫原性.     

面向人脸表情分析的表情空间模型

首先对人脸表情的特点进行分析,给出了表情空间的定性描述.在此基础上,提出了一种兼有离散情感空间模型和连续情感空间模型特点的新的表情空间模型.为了验证该模型的合理性,利用Gabor小波特征和主分量分析方法结合混合高斯模型在人脸表情数据库JAFFE上进行了实验.对不同表情的分布规律进行了实验分析,实现了对表情空间的定性/定量描述.实验结果表明,提出的人脸表情空间模型能够对日常人脸表情进行恰当的表达.     

EGFP-IgG4融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）和IgG4基因的融合蛋白真核表达载体pMM-EGFP-IgG4/WG,转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)中成功表达,并发出绿色荧光,证明pMM-EGFP-IgG4/WG是一种良好的生产分泌型外源融合蛋白的阳性对照.     

pEGFP-N1/PDX1真核载体的构建与表达

目的: 构建胰腺十二指肠同源框蛋白1 (pancreatic and duodenal homeobox factor 1, Pdx1)转录因子真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达能力及其生物活性.方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1基因编码序列,克隆到真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点中,构建pEGFP-N1/Pdx1真核表达质粒,并转染L02细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法和Western Blot检测目的基因表达情况.结果:酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确;RT-PCR检测目的基因Pdx1 mRNA在靶细胞L02中表达;免疫组化和间接荧光结果证实Pdx1主要存在于细胞核内;Western blot检测到细胞核内Pdx1目的蛋白.结论:完成人Pdx1基因克隆,成功构建了目的基因Pdx1真核表达载体,并在L02细胞中获得有效表达.     

3-酮基嘌呤还原酶(TSC10)表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的：Tsc10基因所编码的3-酮基嘌呤还原酶是酵母中神经酰胺合成的重要因子,本文研究从酵母中提取神经酰胺经济、便捷、高效的方法。方法：1.利用构建含有tsc10基因的毕赤酵母GS115表达载体pPIC3.5K-tsc10。2.电转化法将该表达质粒转化到GS115感受态细胞中。3.用G418筛选以及PCR鉴定。4.使用qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测。结果：经过G418筛选以及PCR鉴定后确定获得了包含tsc10基因的毕赤酵母转化子,经过qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测后发现tsc10基因在20个阳性菌株中均可以稳定、高效表达。结论：本方法成功构建了3-酮基嘌呤还原酶高表达的毕赤酵母菌株,并为后续获得高收率神经酰胺奠定了基础。     

Vague 集的三维表示

在分析Vague集性能的基础上，提出了Vague集的一种新的三维表示方法，用空间曲线来表示Vague集的隶属函数，能更直观地反映Vague集所包含的模糊信息，在此基础上给出了该Vague集的相似度量算法，反模糊化算法以及近似推理算法。     

脸部表情动画的实现

用计算机动画技术合成人的面部表情动画是人体动画研究的一个重点。本文分析了人脸的生理结构组成和脸部表情与表情单元形变之间的关系，研究了包括局部变形箱变形、线性局部变形和密度球收缩和舒张变形在内的三种面部肌肉变形方法，在此基础上，提出了一个基于复合多组局部变形操作的脸部表情动画的模拟算法。通过调相关整表情单元的形变因子一时间参数曲线，有效地控制了脸部表情的动画过程，从而实现了脸部表情动画。