利用温敏性凝胶的缓释作用促进变性溶菌酶复性

为了开发温敏凝胶在蛋白质复性方面的方法，利用N-异丙基丙烯酰胺温敏凝胶具有的缓释作用，对变性蛋白质进行了复性．考察不同合成条件下凝胶的性能，结果表明，在制胶温度为22℃、凝胶单体浓度为10％、交联度为5％制得的凝胶，具有较好的机械强度、较大的溶胀倍率、缩水倍率及良好的温敏性能．凝胶的缓释作用对变性还原溶茵酶辅助复性的影响表明，在复性酶终浓度为0．5mg／mL时，凝胶辅助蛋白质的复性收率可达68％，比直接稀释复性（收率为57％）高19％．特别是对高浓度蛋白质的复性（1．5mg／mL），凝胶辅助复性也获得了很好的效果，复性收率高出直接稀释复性37％，表现出温敏凝胶在实际蛋白质复性中的应用前景．     

影响重组凝乳酶原再折叠的主要原因研究

对蛋白质二硫键异构酶与ＧＳＨ／ＧＳＳＧ促进重组凝乳酶原复性进行了比较。ＧＳＧＳＳＧ促进重组凝乳酶原复性的效率低于蛋白质二硫键异构酶，但最终效果相似。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ与蛋白质二硫键异构酶促进重组凝乳酶原复性的反应没有叠加效应。     

用金属螯合柱一步纯化和复性重组人血管生长抑制因子(rhB)

rhB基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在 .利用其产物N端携带 6个连接的组氨酸与金属螯合层析介质中的镍离子的亲和性 ,应用Ni -NTA金属螯合层析在蛋白质变性条件下进行纯化 ,并对纯化样品的复性进行了研究 ,分析和比较了不同复性方法和复性条件对其复性率的影响 .实验结果表明 ,在变性条件下经纯化的样品在Ni柱上不经洗脱 ,用 8.0mol/L～ 1.0mol/L尿素梯度洗涤可使样品在柱上直接复性 .用该法除了可有效地提高复性率外 ,还可使整个纯化过程变得简单、快速和高效 .一步层析即可得到高纯度的且具有生物活性的rhB .     

大分子拥挤试剂对人肌肌酸激酶折叠途径的影响作用研究

为研究大分子拥挤试剂对蛋白质折叠过程的影响作用及其机制提供有价值的依据,在大分子拥挤环境下进行了人肌肌酸激酶的折叠动力学研究,发现质量浓度高的大分子拥挤试剂(ρ=200 g·L-1的BSA、 Dextran 70与Ficoll 70)通过增进部分折叠中间体的错误聚集,使酶的复性产率显著降低.相对质量浓度较低的大分子拥挤试剂(ρ≤100 g·L-1)对酶的复性产率影响不大,但对酶复性的动力学过程有较大影响,一方面可使无活性单体的二聚化变为复性速率最慢的限速步骤,另一方面又加快了二聚化的折叠中间体到天然构象的复性过程.     

L-精氨酸对提高蛋白质复性与纯化率的作用及其分析

分别以还原变性的溶菌酶(Lys)和大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组人酪氨酸激酶配体(Recombined human Flt3ligand,rhFL)为不同来源的变性蛋白,利用荧光光谱技术分析L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)作为小分子添加剂时,蛋白质折叠液相色谱(PFLC)法对变性蛋白质的复性效果,以及变性蛋白复性过程中的复性效率、荧光强度与蛋白构象变化的规律与关系,为解决包涵体蛋白质难于复性和复性效率低的问题提供可靠的数据.     

人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和生物学活性研究

解螺旋酶参与几乎体内所有的DNA代谢,具有重要的生理功能。为了从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,我们以HeLa细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1基因5’端含有1～534核苷酸的cDNA序列一PIFAC。在PIF△C的5’端引入六组氨酸标签后插入pET15b表达载体,得到重组质粒pET15-PIF△C。以此重组质粒转化Rosetta TM2（DE3）感受态细胞,使PIFAC蛋白质在大肠杆菌中得到表达。在4℃通过快速液相色谱纯化系统,通过一系列色谱层析柱纯化了PIFAC蛋白质。以纯化的PIFAC蛋白质免疫家兔制备了抗血清,并检测了纯化的PIFAC的生物化学活性。结果显示不含解旋酶模序的人类PIF1蛋白质的N-末端,具有使单链DNA复性的特性。PIF1解螺旋酶具有解开DNA双链和使双链DNA复性这一矛盾的特性,暗示了人类PIF1解螺旋酶可能参与损伤DNA的修复,包括断裂的双链DNA的修复。     

人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和

解螺旋酶参与几乎体内所有的DNA代谢,具有重要的生理功能.为了从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,我们以HeLa细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1基因5′端含有1～534核苷酸的cDNA序列-PIFΔC.在PIFΔC的 5′端引入六组氨酸标签后插入pET15b表达载体,得到重组质粒pET15-PIFΔC.以此重组质粒转化RosettaTM 2(DE3)感受态细胞,使PIFΔC蛋白质在大肠杆菌中得到表达.在4℃通过快速液相色谱纯化系统,通过一系列色谱层析柱纯化了PIFΔC蛋白质.以纯化的PIFΔC蛋白质免疫家兔制备了抗血清,并检测了纯化的PIFΔC的生物化学活性.结果显示不含解旋酶模序的人类PIF1蛋白质的N-末端,具有使单链DNA复性的特性.PIF1解螺旋酶具有解开DNA双链和使双链DNA复性这一矛盾的特性,暗示了人类PIF1解螺旋酶可能参与损伤DNA的修复,包括断裂的双链DNA的修复.     

葡激酶突变体Y1-Sak的体外变复性研究

具有低免疫原性的双功能葡激酶突变体Y1-Sak(△15,S16K,K74A,E75A,R77A,K109R,F111D)在大肠杆菌中的表达产物为包涵体,必须进行体外变复性才能得到活性.详细研究了复性方式、pH、温度、复性的初始蛋白浓度和添加L-精氨酸对Y1-Sak的体外变复性的影响,发现复性温度和添加的L-精氨酸对Y1-Sak的复性有重要的影响.经过工艺优化后,Y1-Sak的纯化活性回收率达到40%左右,蛋白比活性由20 kU/mg提高到53 kU/mg.用动态光散射分析发现,工艺优化后复性的高比活性Y1-Sak的水合动力学半径与野生型葡激酶相近,分子基本处于单体状态.     

包涵体复性研究

包涵体的形成是外源重组蛋白质在大肠杆菌中高效表达的必然结果，也是目前产生重组蛋白质最有效的方法之一、综述了国内外在外源重组蛋白复性研究方面的主要进展，包括包涵体的分离和溶解、外源重组蛋白复性的原则、影响复性的物理因素及各种复性方法．     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

血管生长素衍生物His13Gly的基因工程研究

在人工合成的血管生长素基因的基础上，利用化学合成的寡聚核苷酸片段，采用掺Ｕ法对ＡＮＧ知性定位眯诱变，同位素杂交筛选到ＡＮＧ基因的衍生物ＩＳ１３Ｇｌ６突变子。     

AiiA融合蛋白包涵体变性和复性的研究

通过IPTG诱导含有pGEXaiiA-B15质粒的工程菌使其大量表达AiiA融合蛋白.由于所表达的融合蛋白多为不可溶的包涵体,须经分离、变性溶解,再经过一个合适的复性过程才能实现变性蛋白的正确折叠,得到具有生物活性的蛋白.通过含N-十二烷基肌氨酸钠的缓冲液A溶液及尿素等变性剂使包涵体溶解,磷酸盐缓冲液透析复性.SDS-PAGE电泳表明包涵体已由不可溶转化成可溶的蛋白.抑菌试验证明复性后的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌引起的马铃薯软腐病有较明显的抑制作用.     

Biochemical characterization of the protein encoded by rice osRACD gene

A recombinant plasmid pET-racd was first constructed by cloning osRACD,the development-regulating gene that controls photoperiod fertility transformation in the photoperiod sensitive genic male sterile rice Nongken 58S,into a prokaryote expression vector pET28a(+).It was then transformed into E.Coli BL-21.Cutting with thrombin of the fusion protein extracted from transformants and PAGE separation yielded pure osRACD protein,which was further concentrated using ultrafiltration and renatured using glutathione oxidation/reduction refolding system for later functional study.As demonstrated by in vitro functional assay,the osRACD protein expressed in E.Coli B-21 shows remarkable activity in binding GTP specifically and hydrolyzing it.     

复性的乙型肝炎病毒X蛋白突变体HBxΔNΔC具有体外生物学活性

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在肝炎引起的肝癌病变中作为一个多功能调节因子起着关键的作用.对HBx的功能有非常多的体外研究报导,而由于HBx蛋白难以溶解和稳定使得体外的研究报导非常少.我们根据肝癌患者中最常见的截短突变体,在大肠杆菌包涵体中重组表达了一个保留了第12～127位氨基酸的、N端和C端截断的突变体HBxΔNΔC,并使用变复性的方法将其复性溶解.分子筛显示HBxΔNΔC为单体;圆二色谱显示HBxΔNΔC包含有5％的α-螺旋,30％的β-折叠和65％的其他结构.复性的HBxΔNΔC能从人HepG2细胞中拉下(pull-down)肿瘤抑制因子p53和DDB1蛋白,它还能刺激肝细胞的迁移.腹腔注射1μg/g的HBxΔNΔC能明显刺激小鼠肝的生长.这些结果显示HBxΔNΔC具有一定的生物学活性,它可以用来研究体外的HBx结构和分子作用机制.     

多功能蛋白增活器的研制及性能研究

自制了一种新型的多功能蛋白增活器,它具有同时除变性剂、分离杂蛋白、复性目标蛋白及便于回收变性剂的功能。考查了其对蛋白的分离、复性性能。发现这种多功能蛋白增活器可对６种标准蛋白进行良好地分离。同时对盐酸胍变性的溶菌酶和核糖核酸酶完全复性。通过测定压力－流速曲线,发现多功能蛋白增活器的压力均远远低于普通色谱柱。将其应用于基因工程发酵的粒细胞集落因子（Ｇ－ＣＳＦ）的分离纯化,可使纯度接近于１００％,生物活性大于常规方法３倍     

Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process

Subtilisin E, an alkaline serine protease consisting of a single polypeptide chain of 275 amino acids is produced from a pre-pro-protein. The pre-sequence functions as the signal peptide for protein secretion across the membrane. Deletion of the pro-sequence yields mature but inactive subtilisin: the 77-amino acid pro-sequence must precede the mature subtilisin to guide the latter into an active conformation. Pro-subtilisin denatured in 6 M guanidine-HCl can be self-processed to the active enzyme intramolecularly, with concomitant cleavage of the pro-sequence, when dialysed against renaturing buffer. We have constructed an active-centre mutant of pro-subtilisin (Asp 32----Asn) which is not processed to active enzyme, unlike the wild-type pro-subtilisin, because intramolecular processing is prevented. Here we report an intermolecular pathway for the refolding of the inactive mature protein to an active enzyme in vitro with the aid of exogenously added pro-sequence. We establish conditions under which the mature inactive form, as well as acid-denatured subtilisins Carlsberg and BPN', can be renatured by the mutant pro-subtilisin.     

透析法和稀释法复性重组人Cu,Zn-SOD包含体

以稀释法和透析法对在E.coli中以包含体形式表达的重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)进行复性.以8 mol/L尿素溶解分离纯化的包含体(纯度达80%以上),对其稀释或透析至尿素终浓度为1.0 mol/L后,在稀释样品中补加终浓度50μmoL/L的Cu2+和5.0μmoL/L的Zn2+,在透析样品中补加终浓度5.0μmoL/L的Cu2+和0.5μmoL/L的Zn2+,分别获得了比活3 300 u/mg和4 300 u/mg的复性rhSOD.该复性样品经铜螯合亲和层析柱纯化可获得更高比活性的rhSOD.     

蚯蚓抗菌肽40 kD Fetidin基因的原核表达与复性

40 kD的fetidin是存在于蚯蚓体腔液中的一种具有较好抗菌活性的蛋白.为了获得大量fetidin,从蚯蚓(Eisenia fetida)中调取fetidin的基因,分别克隆到pKW32和pMXB10中,构建了融合和非融合表达载体,并转化大肠杆菌进行诱导表达.结果无论是融合还是非融合表达,产物均以包含体形式存在.融合表达产物通过亲和层析获得复性,复性产物对粘质沙雷氏菌具有抗菌活性.     

中国大鲵(Andrias davidianus)二十四种组织器官的碱性磷酸酶(AKP)初步分析

用酶的原位复性电泳方法分析了中国大鲵二十四种组织器官的碱性磷酸酶。结果表明,二十四种组织器官中都有碱性磷酸酶存在,其中230和200 KD的碱性磷酸酶占优势;不同组织器官的碱性磷酸酶活性有差异,心脏中活性最强,眼球中活性最弱;在同一组织中,230和200 KD的碱性磷酸酶活性也有差异。另外,在肾脏和心脏中还含有一种250 KD的碱性磷酸酶,推测与器官的功能有关。