增加雷斯青霉15α–羟化酶基因拷贝数提高甾体转化效率

孕二烯酮是第三代高效避孕药的主要成分.雷斯青霉(Penicilliumraistrickii)ATCC10490催化甾体左旋乙基甾烯双酮的C15α–羟基化反应合成孕二烯酮的重要中间体C15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.为了提高现有生产菌种的转化效率,本文研究了在雷斯青霉ATCC10490中增加甾体C15α–羟化酶基因(PRH)拷贝数对转化效率的影响.分别构建了PRH基因的诱导型和组成型过表达载体pPZP-p800-PRH和pPZP-TrpC-PRH,并通过同源重组的方法定点整合到雷斯青霉基因组.转化实验表明,在出发菌株中增加一个PRH基因拷贝显著提高了甾体左旋乙基甾烯双酮转化效率,重组菌PRH-P800和PRH-TrpC的摩尔转化率分别提高了13%和20%,同时转化时间均缩短了12 h.     

雷斯青霉转化左旋乙基甾烯双酮150α-羟基化反应工艺研究

对雷斯青霉(Penicillium raistrickii)微生物转化左旋乙基甾烯双酮15α-羟基化反应的培养基组成和转化条件进行优化.结果表明:优化后最佳培养基组分为葡萄糖30g/L,玉米浆20g/L,NaNO3 2g/L,KH2P O41g/L,K2HP O42g/L,MgSO40.5g/L,FeSO4 0.02 g/L,KCl 0.5 g/L;最适转化条件为接种量10%,初始pH7.5,摇瓶装量50 mL,转化温度28℃,投料量0.2%,投料时间30h,转化时间60h,底物添加方式为底物超声粉碎后加4%甲醇和1.5%吐温80溶解.在此条件下,摇瓶转化率可达70%以上.     

转化左旋乙基甾烯双酮的微生物筛选及转化产物研究

为了满足甾体药物日益增长的市场需求,从南方采集的新鲜树皮中筛选出具有转化新型甾体化合物左旋乙基甾烯双酮活力的微生物米根霉.利用该菌对左旋乙基甾烯双酮进行生物催化,转化产物经纯化、重结晶后,通过单晶衍射鉴定为6,β–羟基–13,β–乙基–4–烯–3,17–二酮和10,β–羟基–13,β–乙基–4–烯–3,17–二酮.通过高效液相色谱对转化过程中的甾体化合物进行分析,发现转化24,h后,底物左旋乙基甾烯双酮、6,β–羟基化产物和10,β–羟基化产物的含量分别为28.4%、32.2%和35.7%.     

雷斯青霉转化左旋乙基甾烯双酮15α-羟基化反应工艺研究

对雷斯青霉（Penicillium raistrickii）微生物转化左旋乙基甾烯双酮15α-羟基化反应的培养基组成和转化条件进行优化．结果表明：优化后最佳培养基组分为葡萄糖30g／L,玉米浆20g／L,NaNO3 2g／L,KH2PI4 1g／L,K2HPO4 2g／L,MgSO4 0．5g／L,FeSO4 0．02g／L,KCl 0．5g／L;最适转化条件为接种量10％,初始pH7．5,摇瓶装量50mL,转化温度28℃,投料量0．2％,投料时间30h,转化时间60h,底物添加方式为底物超声粉碎后加4％V醇和1．5％吐温80溶解．在此条件下。摇瓶转化率可达70％以上。     

利用固定化微生物细胞羟基化左旋乙基甾烯双酮

研究了海藻酸钙包埋法固定化技术在甾体化合物的生物转化中的应用.利用固定化 Penicillium raistrickii 细胞实现对左旋乙基甾烯双酮（13-ethyl-estr-4-ene-3,17-dione）的15α 位羟基化作用,合成了重要的药物中间体15α-羟基左旋乙基甾烯双酮.优化了固定化孢子浓度,固定化孢子接种量,投料浓度,投料时间,转化时间等转化条件.结果表明：在摇瓶发酵生物转化中,固定化 Penicillium raistrickii 细胞可重复利用5次而转化能力没有明显下降.     

雷斯青霉NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆及生物信息学分析

工业上利用丝状真菌雷斯青霉(Penicillium raistrickii)转化生产高效避孕药孕二烯酮的关键中间体15α–羟基左旋乙基甾烯双酮.已知参与雷斯青霉甾体转化反应的关键酶为P450羟化酶,该羟化酶体系由细胞色素P450羟化酶和NADPH–细胞色素P450还原酶(CPR)组成,但有关其15α–羟基化反应的分子基础尚不清楚.根据转录组测序数据库,通过RT-PCR扩增克隆了一个雷斯青霉NADPH-细胞色素P450还原酶基因.该基因的开放阅读框为2,082,bp,编码694个氨基酸的多肽链,预测的蛋白相对分子质量为7.63×104,具有CPR蛋白的典型结构域(FMN结合域、FAD和NADPH结合域).NCBI BLAST结果显示雷斯青霉CPR与意大利青霉(P.,italicum)NADPH–细胞色素P450还原酶具有较高的同源性,一致性为93%.     

赭曲霉甾体11α–羟化酶基因AOH在毕赤酵母中的表达及功能分析

11α–羟基左旋乙基甾烯双酮(11α-OH-GD)是生产高效避孕药去氧孕烯的关键中间体.丝状真菌赭曲霉(Aspergillus ochraceus)TCCC41060可以转化左旋乙基甾烯双酮(GD)形成11α-OH-GD,但该转化反应特异性低,副产物偏高,限制了其工业应用.为了研究赭曲霉转化GD特异性偏低的机理,本文克隆了赭曲霉11α–羟化酶基因AOH并构建了表达载体p PIC3.5,K-AOH,获得了重组毕赤酵母菌株.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹实验(Western blot)分析表明,AOH重组蛋白相对分子质量为6.12×104,与预测结果一致.对转化产物进行薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析结果显示,AOH重组菌株能够转化GD,形成目标产物11α-OH-GD以及3种副产物.以上结果表明:AOH基因编码的甾体11α–羟化酶对底物GD转化反应的特异性较差.     

表面活性剂对赤霉菌双羟化去氢表雄酮的影响

考察了表面活性剂对Gibberella intermedia CA3-1双羟化去氢表雄酮生成三羟基雄甾烯酮的影响。在转化体系中添加表面活性剂可以加快Gibberella intermedia CA3-1羟化去氢表雄酮的转化反应并使产物三羟基雄甾烯酮的得率有所提高。Tween-80对转化促进作用明显,在底物投料质量浓度为8g／L,转化72h时产物得率达到53％,较对照实验提高了约5％。研究了表面活性剂添加量对转化的影响以及其对茵体生长的影响,推测表面活性剂促进甾体转化的原因,为表面活性剂在甾体生物转化反应中的应用奠定了基础。     

分支杆菌降解大豆甾醇侧链的发酵研究

对分支杆菌(MycobacteriumspJY 1)降解大豆甾醇(BS)侧链至4 烯 雄甾 3,17 二酮(4 AD)和1,4 二烯 雄甾 3,17 二酮(ADD)的培养基组成、种子培养时间、通气量、投料方式及时间等发酵条件进行了研究。在投料浓度为0.3%,转化时间为168h的条件下,使4 AD(D)的转化率由原来的37%提高到50%左右。     

离子液体[Hmim]BF4催化合成β-烯胺酮类化合物

合成了一系列具有不同阴离子的[Hmim]+ 咪唑型离子液体,并考察了催化剂在β-烯胺酮合成中的催化性能.结果表明,[Hmim]+ 咪唑型离子液体对β-烯胺酮合成具有高的催化活性,其中[Hmim]BF4活性最高,反应时间为10 min,产率可达96%;将该催化剂用于催化不同底物的β-烯胺酮化合物的合成,多数反应显示了优良的催化性能.离子液体[Hmim]BF4重复使用5次,催化活性基本不变,反应10 min后,β-烯胺酮产率仍有89%.     

离子液体双相体系中的生物催化维生素D_3羟基化反应

为探究离子液体双相体系中蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HDZJU1-11羟基化维生素D_3的生物催化反应,比较了5种离子液体([PrMIm][PF6],[BMIm][PF6],[BMIm][NTf2],[HMIm][PF6],[OMIm][NTf2])对底物的溶解能力以及与实验菌株的生物相容性;优化了离子液体双相体系中相比(水相与离子液体相的体积比)、pH及底物浓度等条件,选择[BMIm][PF6],[BMIm][NTf2]及[OMIm][NTf2]作为构建双相体系的离子液体.对[BMIm][PF6]/水双相体系而言,菌体生长12h后进行转化,相比为4∶1,水相pH为7.5,离子液体中底物浓度为0.5mg/mL时,24h后产物25-羟基维生素D_3浓度最高达0.38mg/mL.结果表明,离子液体双相体系可成功应用于蜡状芽孢杆菌羟基化维生素D_3的转化反应,为放大实验与工业化生产提供了理论支持.     

宽叶鼠麴草化学成分的研究

对滇产宽叶鼠麴草(Gnaphalium adnatum)枝叶粗提物进行化学成分研究,采用反复硅胶柱层析、重结晶的方法分离纯化得到14个化合物,通过现代谱学方法和理化常数测定鉴定了它们的结构,分别为:7-O-(2′-异戊烯基)-5-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮(1),7-O-(β-D-葡萄糖苷)-5-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮(2),5,7-二羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮(3),银椴苷(4),4-(3′,4′-苯甲氧基)-3-甲基-3-烯-2-酮(5),对苯二甲酸-(正丁基-异丁基)-二醇酯(6),3β-香树脂醇(7),4,22-二烯-3-酮豆甾烷(8),4,22-二烯-3-酮-6β-羟基豆甾烷(9),5,22-二烯-7-酮-3β-羟基豆甾烷(10),5-烯-7-酮-3β-羟基豆甾烷(11),二十四烷酸甘油酯(12),豆甾醇(13),胡萝卜苷(14).所有化合物均为首次从该植物中分离得到,其中化合物1～12为首次从该属植物中分离得到.     

甾体药物安宫黄体酮中杂质的分离和鉴定

应用柱色谱方法对安宫黄体酮多次重结晶母液中所含的杂质进行了分离和纯化,并应用NMR和MS等波谱方法确定了5个孕甾烷型杂质的结构:17α-氧乙酰基-6α.甲基孕甾一3,20-二酮、17α-氧乙酰基孕甾4-烯-3,20-二酮、17α-氧乙酰基孕甾4-烯.20-酮、17α-氧乙酰基-6β羟基-6α-甲基孕甾4-烯-3,20-二酮、17α-氧乙酰基-6α-羟基-6β-甲基孕甾4-烯-3,20-二酮.为安宫黄体酮的质量控制及代谢研究提供了依据.     

6-氧代-谷甾-3β-硫酸酯钠和6-氧代-谷甾-4-烯-3β-硫酸酯钠的合成

由谷甾醇1经过PCC氧化得到谷甾-4-烯-3,6-二酮2.2在镍离子或钴离子存在的条件下,用硼氢化钠进行选择性还原得到3-羟基-谷甾-6-酮3或4.3或4被三乙胺-三氧化硫复合物硫酸酯化,得到产物5或6.5或6用阳离子(钠型)交换树脂进行Na+交换得到目标产物6-氧代谷甾-3β-硫酸酯钠7和6-氧代谷甾-4-烯-3β-硫酸酯钠8.     

水相中离子液体[ADPQ][BF_4]催化“一锅法”合成四氢苯并[b]吡喃

目的:制备1种以4-氨基奎宁为基础的离子液体,催化3组分一锅法制备四氢苯并吡喃的反应.方法:以水为溶剂,反应底物为芳香醛、活性亚甲基化合物和双甲酮.结果:最佳反应条件为:催化剂用量为芳香醛摩尔量的15%,反应温度为60℃,以水做溶剂.在此条件下,尝试的底物反应时间均在2 h内,收率为83%~96%.结论:该催化体系反应条件温和,时间短,收率高,反应后处理简单,催化剂重复使用4次催化效果变化不大.     

双肾藤茎枝甾体类化学成分的分离鉴定

【目的】系统研究药用植物双肾藤(Bauhinia glaucasubsp.hupehana)茎枝的化学成分,明确其药用物质基础。【方法】采用硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析等分离技术,从双肾藤茎枝中分离甾体类单体化合物,运用理化和波谱分析方法鉴定其化学结构。【结果】从双肾藤茎枝分离获得6个甾体类化合物,分别鉴定为(24R)-5α-豆甾烷-3,6-二酮(1)、(22E,24R)-麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮(2)、(24R)-5α-豆甾-4-en-3,6-二酮(3)、豆甾烷-4-烯-3-酮(4)、β-谷甾醇(5)、胡萝卜苷(6)。【结论】从双肾藤中分离获得的甾体类化合物包括甾醇、甾酮和甾体苷,其中化合物1和2均为首次从该属植物中分离得到。     

覆盆子酮香料的绿色合成研究

以离子液体为催化剂和反应媒介,将其用于苯酚和丁烯酮的反应中合成覆盆子酮;考察了离子液体阴阳离子结构、离子液体用量、底物配比、反应温度和时间对合成覆盆子酮反应性能的影响.结果表明,以酸性离子液体[BMIM]HSO4为催化剂,n(苯酚)∶n(丁烯酮)=1∶2,25℃反应12 h时,覆盆子酮的产率可达73%.使用酸性离子液体催化合成覆盆子酮具有反应操作简便、后处理简单、未反应的原料和催化剂可以循环使用、不使用任何有毒催化剂和有机溶剂等优点,是一种绿色环保的合成覆盆子酮的新方法.     

紫红红球菌9α–羟化酶loop对酶活性的影响

3–甾酮–9α–羟化酶是转化雄甾–4–烯–3,17–二酮生成9α–羟基雄甾–4–烯–3,17–二酮的关键酶,其加氧酶组分在底物进入酶活性中心入口处,存在一个由16个氨基酸构成的柔性loop.为了明晰loop对酶活性的影响,利用定点突变技术对loop上结构变化较大的氨基酸进行研究,解析出了各氨基酸的作用,T224、N225、Y226与周围α5螺旋和β折叠存在一定相互作用,共同调节底物通道与底物运送能力;D227和D228起到支撑固定loop结构的作用,使T224–Y226能与其周围的氨基酸产生相互作用.这为进一步采用蛋白质工程改造9α–羟化酶提供了理论依据.     

对称的吡嗪双甾体的简便合成方法

吡嗪双甾体是一类结构复杂的甾体-生物碱杂化体,它们不仅具有独特的化学结构,而且表现出极其显著的抗肿瘤活性.由于此类化合物的天然来源极其有限,所以吡嗪双甾体的应用有待于化学方法合成来实现.该文以甾体类化合物番麻皂甙元(hecogenin)、胆甾醇(cholesterol)、麦角甾醇(ergosterol)、豆甾醇(stigmasterol)等为原料,经羟基氧化及Rubottom氧化得到α-羟基酮甾体衍生物,将所得α-羟基酮与醋酸胺作用,一步合成得到对称的吡嗪双甾体类化合物.利用这种方法制备得到了10个对称的吡嗪双甾体类化合物,其中7个吡嗪双甾体未见报道(化合物7,14,25,26,28,29及35).与文献报道的方法相比,该研究工作简化了对称的吡嗪双甾体类似物的合成方法,为此类化合物的合成及进一步的活性研究打下了基础.     

用海藻酸钙包埋法固定化蓝色梨头霉菌生产氢化可的松的初步研究

初步研究了海藻酸钙包埋法固定化技术在氢化可的松生产中的应用。确定了底物R.S.A的最佳投料时间为32h、最适的固定化梨头霉菌孢子液浓度为5×106个/mL,选择洗衣粉作为表面活性剂的最适添加量为0.04%。确定了固定化霉菌培养基的最优组成。结果表明,固定化的梨头霉菌重复使用5次以后,其羟基化酶的转化能力没有明显下降。