基于cdd基因敲除和嘧啶操纵子转移的胞苷产生菌的研究

以大肠杆菌作为出发菌株,通过基因工程手段对其进行改造,旨在提高胞苷产量.首先,通过Red重组系统敲除了大肠杆菌MG3028基因组上的胞苷脱氨酶基因(cdd),阻断了胞苷的分解代谢.然后,构建了含解淀粉芽孢杆菌TS8嘧啶操纵子结构基因的重组质粒pPYR3021,并将其转入E.coli MG3028(△cdd).与出发菌株E.coli MG3028相比,E.coli MG3028(△cdd)的胞苷产量提高了近2倍,而尿苷产量降低了近75%,携带重组质粒pPYR3021的菌株胞苷产量较出发菌株提高了近6倍.     

诺卡氏菌腈水合酶突变基因在重组大肠杆菌中的高活性表达

为了提高腈水合酶基因的重组表达水平,提出了3种基因策略:在重组大肠杆菌中共表达激活子序列、在重组毕赤酵母中表达以及对α亚基的起始密码子进行定点突变。结果表明:对α亚基的起始密码子进行定点突变的基因策略为最佳方案,突变后的腈水合酶基因在重组E.coli XL1-Blue(pUC18-NHBAM)中表达时,腈水合酶的比酶活(以干菌质量计)提高到51 U/mg。进一步以pET28a为载体,插入突变后的腈水合酶基因,构建重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETNHM。对优选菌株进行培养条件和诱导条件的优化,腈水合酶的最高比酶活达到450 U/mg。     

通过DNA shuffling技术获得初步解除苯丙氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(AroG)突变株

aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase,AroG)是苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,分别以Escherichia coli(E.coli)野生型和突变型aroG基因以及Sal monella typhi mnrium(S.typhi mnrium)野生型aroG基因为亲本,通过DNA suffling技术对aroG进行改组,获得的改组分子与载体pET30a连接得到改组文库,转化到E.coliBL21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得4个解除Phe反馈抑制的克隆.     

定点突变提高豆豉纤溶酶的酶活力和底物特异性的研究

以pBE—DFE质粒为模板,采用反向长距离PCR技术对豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme,DFE)基因进行定点突变,使位于酶的底物结合区第156位的谷氨酸和第166位的甘氨酸分别替换为丝氨酸和丙氨酸,使临近酶的底物结合区的第169位甘氨酸残基替换为丙氨酸,获得了三个突变体E156S,G166A和G169A.将含突变基因的表达载体转化枯草杆菌WB800,构建了豆豉纤溶酶基因突变体的表达菌株WB800(E156S);WB800(G166A)和WB800(G166A).将3种表达菌株进行液体发酵培养,结果发现发酵上清液中纤溶酶的纤溶活性为460,790和900U/mL,分别是未突变酶活性(660U/mL)的70%,115%和136%;3种突变酶对合成底物的H-D-Val-Leu-Lys-pNA的酰胺水解活性是未突变酶的17%,125%和121%.     

K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶基因的定点突变及其性能研究

针对菌株K.pneumoniae XJPD—Li高效转化生产1,3-丙二醇的特性,将其甘油脱水酶与已知报道的甘油脱水酶（U60992）的序列比对分析,根据差异位点设计了Nβ471的定点突变,利用反向PCR定点突变技术构建了甘油脱水酶（dhaBCE）的突变体质粒M1821,并在E．coli BL21（DE3）中高效表达。SDS—PAGE结果显示,诱导表达后在相对分子质量66、24、16KD出现三条特征条带,与预期结果一致。突变体M1821甘油脱水酶的比酶活为38．7U／mg,催化反应最适pH为8．0,最适温度为40℃,与未突变重组甘油脱水酶比较,最适温度降低了约5℃。     

利用DNA shuffling构建部分解除对氟苯丙氨酸反馈抑制的aroG

3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPs)是芳香族氨基酸生物合成途径中关键的限速酶,在大肠杆菌中有3种同工酶,分别由aroG(Phe)、aroH(Trp)和aroF(Tyr)基因编码,这3种酶分别受苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,以Escherichia coli野生型aroG、aroH和aroF基因为亲本,通过DNAshuffling技术对aroG基因进行改组,将获得的改组aroG与载体pET30a连接得到改组文库,转化到E.coliBL21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得2个能耐受10 mg/mLp-FP的克隆.这2个克隆的测序结果显示,其中一个发生了3个点突变:C129T,A531G,A1032G;另一个发生了3个点突变T77A,G883A,A1032G和4个碱基的插入突变即922位插入A,943位插入CG,971位插入A.2个改组AroG的最适pH和最适温度与野生型AroG相比无明显变化.     

铜绿假单孢菌yfa操纵子中α2-M基因与抵抗力的关系

目的研究铜绿假单孢菌yfa-α2M基因与其抵抗力的关系。方法通过基因敲除的方法,得到铜绿假单孢菌的突变株PAO1Δyfa-α2M。在不同的底物存在的条件下,比较突变株和野生型菌株的生长曲线。结果突变株PAO1Δyfa-α2M对Polymixin的抗性明显降低。结论基因yfa-α2M可能与铜绿假单胞菌的抗性有关。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶M372I-T379S双突变体的构建及其酶学性质

为构建高酶活力天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK), 并削弱或解除Lys(lysine)反馈抑制作用突变体, 通过定点突变和高通量筛选技术构建突变体M372I,T379S和M372I-T379S, 对野生型（WT）和突变体分别进行诱导表达、 纯化及酶学性质表征. 结果表明： 突变体M372I,T379S和M372I-T379S AK与WTAK相比, V_max分别提高了13.77,15.02,15.60倍, K_m和n值均降低； 最适pH值分别升高为8.0,8.5,8.5, 且半衰期分别延长了1.0,0.9,2.3 h； M372I-T379S AK最适温度为30 ℃, 比WT AK高2 ℃； 当浓度为1~10 mmol/L时, 突变体均削弱或部分解除了抑制剂Lys的反馈抑制作用.     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶M372I-T379S双突变体的构建及其酶学性质

为构建高酶活力天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK), 并削弱或解除Lys(lysine)反馈抑制作用突变体, 通过定点突变和高通量筛选技术构建突变体M372I,T379S和M372I-T379S, 对野生型（WT）和突变体分别进行诱导表达、 纯化及酶学性质表征. 结果表明： 突变体M372I,T379S和M372I-T379S AK与WTAK相比, V_max分别提高了13.77,15.02,15.60倍, K_m和n值均降低； 最适pH值分别升高为8.0,8.5,8.5, 且半衰期分别延长了1.0,0.9,2.3 h； M372I-T379S AK最适温度为30 ℃, 比WT AK高2 ℃； 当浓度为1~10 mmol/L时, 突变体均削弱或部分解除了抑制剂Lys的反馈抑制作用.     

突变型大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因的合成

利用PCR定点突变技术，以野生型大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因为模板，获取3种突变型(Cys85Ser．Cysl51Ser，Cys85／151Ser)二氢叶酸还原酶(DHFR)基因．用限制性内切酶BamH Ⅰ与Pst Ⅰ将3种突变基因片段插入到克隆载体pUC18上，进行蓝白筛选，将筛选的克隆进行DNA序列测定．     

宁夏牛源克雷伯菌和大肠埃希菌分离株产超广谱β-内酰胺酶基因型检测

为了解宁夏牛源产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）和大肠埃希菌（Esche-richia coli）的耐药性和基因型分布,采用美国临床实验室标准化研究所（CLSI）2008年推荐的双纸片确证试验,对宁夏地区100株克雷伯菌和大肠埃希菌进行产ESBLs确定,并采用PCR扩增法和克隆测序法对产ESBLs菌株进行基因分型.结果显示,宁夏地区有42株产ESBLs菌株,阳性率为42%;其中31株菌扩增呈阳性,产TEM型菌17株,产SHV型菌14株,产CTX型菌15株;同时产3种基因型菌1株,同时产2种基因型菌13株,产单一基因型菌17株,分别占产ESBLs菌株的2.38%,30.95%,40.48%;多表现为多重耐药.     

泡桐内生枯草芽孢杆菌JDB-1草菌素的抑菌活性及其spaS基因的克隆

用硫酸铵沉淀法从泡桐内生枯草芽孢杆菌JDB-1发酵液中粗提枯草菌素,采用纸片扩散法和琼脂糖扩散法分别检测枯草菌素对细菌和真菌的抑菌活性,采用PCR从菌株JDB-1基因组DNA中扩增出枯草菌素基因spaS,并克隆到pMD18-T载体,测定spaS基因的核苷酸序列.结果表明硫酸铵粗提的枯草菌素对大肠杆菌K12、恶臭假单胞杆...     

重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a( )中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础     

毒性小分子蜂毒肽基因的克隆修饰、融合载体构建及表达研究

通过定点诱变的方法,对小分子蜂毒肽（melitin）基因进行修饰,引入了羟胺裂解位点,使蜂毒肽与其前体蛋白得以在体外融合表达．将融合的蜂毒肽前体蛋白（prcmelittin）经双酶切后克隆到原核表达载体PET-42a（＋）中,PCR鉴定后转化至宿主菌BL21（DE3）中,在异丙祭硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,在大肠杆菌中实现融合表达．为利用基因下程的方法表达毒性小分子多肽、实现该类药物的产业化打下基础．     

Lrrc10蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET-Lrrc10和Lrrc10蛋白表达,利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体pMD18-T-Lrrc10,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a(+),转入E.coli strainDH5α,菌落PCR筛选阳性菌落,提取阳性菌质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E.coli strain BL21(DE3),于37℃振荡培养,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrc10。转入E.coli strain BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

养禽场周围水环境中磺胺类抗性菌、抗性基因分布

为进行养禽场周围水环境中磺胺类抗性菌、抗性基因分布的研究,从3家养禽场多个区域水环境中分离的56株大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli),应用肉汤微量稀释法分析磺胺类药物敏感性,应用PCR方法检测磺胺类药物抗性基因。结果有18株(32.14%)磺胺类抗性菌,对利福平的耐受性最弱,对氯霉素的耐受能性最强;共检测到64个抗性基因,三个养禽场分别为:19(29.69%)、29(45.31%)、16(25.00%);分别为sul1 18(28.12%)、sul2 13(20.32%)、sul3 7(10.94%)、Int1 18(28.12%)、Int2 8(12.50%)。含一种抗性基因的菌株为1株、含2种抗性基因的菌株为1株、含三种抗性基因的菌株为6株、含四种抗性基因的菌株为5株、含五种抗性基因的菌株为4株,而1株无抗生素抗性的菌株检出抗性基因。结果表明在养禽场场内检测到抗性基因和抗性菌株数量较高、养禽场周围水环境中存在磺胺类抗性菌株,且具有多重抗性,可能对生态环境的产生一定的不良影响。     

链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶（MTG）在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明：经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.     

用亮氨酸抗性法选育L-甲硫氨酸高产突变株

用亮氨酸(Leu)抗性为标记筛选L-甲硫氨酸(L-Met)高产突变株．以一株具有M-海因水解酶系统的芽孢杆菌MV0073为出发菌株，经过6轮紫外诱变，筛选出27株抗亮氨酸的L-Met高产突变株．其中突变株M604的L-Met产量是出发菌株的3倍，且培养液中积累的高含量L-Met能在培养后期稳定持续，M604连续传代6次，遗传性状稳定，表明用Leu抗性选育L-Met高产突变株是一种切实可行的方法。