αA干扰素基因在酿酒酵母中的表达

将含有αA干扰素基因的DNA片段接上化学合成的EcoR I-Hind III转换接头,然后插入酵母分泌型表达载体YFD 18中,构建成质粒YFD 66和YFD66-0.转化酵母菌BJl991后,得到转化子BJ1991/YFD66和BJl991/YFD66-0.干扰素活性测定表明,每升BJ1991/YFD66培养液含有αA干扰素10~6U,而BJ1991/YFD66-0则不产生干扰素,YFD66为αA干扰素表达质粒。     

ASP—ChIFN-α融合基因的构建及表达

利用PCR技术从宁夏地方三黄肉鸡肝组织中扩增出α干扰素基因,构建成原核重组表达质粒pET-28a/(ChIFN-α从埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ(L-Asmraginase,ASP)信号肽基因,并与原核重组质粒pET-28a/ChIFN-α连接,构建成分泌型表达重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α将重组质粒经IPTG诱导5 h.用SDS-PAGE分析表达蛋白含量,并用鸡α-干扰素ELISA(Western-blot)试剂盒检测表达的重组蛋白的特异性.结果表明,包涵体型重组质粒pET-28a/ChIFN-α和分泌型重组质粒pET-28a/ASP-ChIFN-α在23 kD处均表达出目的蛋白,蛋白含量分别为27%和38%,pET-28a/ASP-ChIFN-α的蛋白表达含量比pET-28a/ChlFN-α的蛋白表达含量要高出11%,表达的重组蛋白具有特异性.实验实现了鸡α-干扰素成熟蛋白基因的高效表达,筛选出了可应用于临床的鸡α-干扰素高效表达菌株BL21(DE3)(pET-28a/ASP-ChIFN-α).     

融合胸腺素α1的猪干扰素α在毕赤酵母中的表达及效价测定

猪干扰素α(IFN-α)是在特定条件下由细胞产生的一种具有广谱、高效抗病毒活性的可溶性糖蛋白,胸腺素α1(Tα1)是一种具有免疫调节的活性肽.本研究中将Tα1基因与去掉信号肽序列的猪IFN-αN端融合,构建酵母表达载体PHBM-Tα1-IFNα,同时构建单独表达IFNα的重组质粒PHBM-IFNα,重组质粒电转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株,甲醛诱导表达.利用SDS-PAGE法检测融合蛋白的表达,并用细胞病变抑制法测定干扰素的效价.实验结果表明,酵母表达上清中IFNα的效价为2.916×10~6U/m L;Tα1-IFNα的效价为2.860×10~7U/m L,该结果证实胸腺素α1可提高融合表达蛋白猪干扰素的活性,因此,通过酵母表达体系获得高活性胸腺素-猪干扰素融合蛋白,可为高效、低成本获得抗病毒药物提供一种新的模式.     

重组猪α-干扰素的纯化及生化性质鉴定

对巴斯德毕赤酵母高效分泌表达的猪α-干扰素(PoIFN-α)纯化工艺和纯化后重组蛋白的部分生化特性进行了研究,结果表明:猪α-干扰素(PoIFN-α)发酵液经离心、透析、过滤处理之后,依次利用亲和层析和离子交换层析使目的蛋白得到了纯化.经N端氨基酸测序,Westem-blot,对酸、热、巯基乙醇的稳定性和糖基化程度等检测后发现,所表达的猪α-干扰素N端氨基酸序列(前5个)正确,对酸和热基本稳定,二硫键对目的蛋白的活性至关重要,没有发现目的蛋白的糖基化.     

山香圆总黄酮对慢性咽炎模型大鼠 NF-κB、IκBα表达的影响

以2.5%氨水喷咽部建立大鼠慢性咽炎模型,用HE染色法观察咽部病理形态学改变,用ELISA法检测血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6,用RT-qPCR测定咽部组织NF-κBp65mRNA的表达,用Western blot检测咽部组织NF-κBp65和IκBα蛋白的表达,探讨山香圆总黄酮对慢性咽炎模型大鼠 NF-κB、IκBα表达的影响.结果显示:山香圆总黄酮能明显改善模型大鼠咽部病理形态学; 与模型组比较,山香圆总黄酮各组能不同程度地下调TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κBp65的表达并上调IκBα的表达,其中高剂量组最显著.这表明山香圆总黄酮能通过抑制NF-κB的表达和IκBα的解离下调炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,从而减轻炎症,发挥抗慢性咽炎作用.     

α2b干扰素基因与Ag85B基因在毕赤氏酵母中的融合表达

Ag85是结核分枝杆菌的一种分枝菌酸转移酶复合体,在结核分枝杆菌的细胞壁合成过程中起着重要作用Ag85B是该复合体的一个组分,具有较好的免疫原性通过连接多肽（G4S）4的编码序列,将α2b干扰素基因与Ag85B基因连成融合基因,然后克隆到毕赤氏酵母表达载体pPIC9上,转化Pichia pastoris SMD1168后获得重组酵母工程菌SMD1168／pPIC9-α2bAg85B,经甲醇诱导培养,发酵上清液经抗病毒活性测定,Western blot鉴定以及初步纯化,结果表明,分泌表达的融合蛋白具有一定的抗病毒活性．     

重组人干扰素α-2b工程菌培养条件的优化研究

对重组人干扰素α-2b工程菌的培养条件、诱导条件进行研究.提高菌体目标蛋白表达量.通过实验条件的优化确定了适合重组人干扰素α-2b表达的诱导温度、诱导时间和诱导收获时间等.改进工艺后,目的蛋白的表达量大大提高,为进一步的下游工艺的开发奠定了基础.     

二苯乙烯苷通过抑制NF-κB信号通路减轻TNF-α诱导的人脑微血管内皮细胞损伤

目的探讨二苯乙烯苷(TSG)如何保护TNF-α诱导的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)损伤。方法体外培养HBMECs,然后用TNF-α分别诱导经TSG以及NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸盐(PDTC)处理过的细胞,并检测细胞活力以及NF-κB p65和caspase-3的蛋白水平。结果 TNF-α能诱导HBMECs中NF-κB p65、caspase-3蛋白表达,而TSG则能抑制NF-κB p65、caspase-3的表达。相对于TNF-α单独处理组,用TSG或PDTC处理经TNF-α诱导的HBMECs细胞,能显著提高细胞活力,其机制是通过抑制NF-κB p65、caspase-3的蛋白表达从而起到保护作用。结论 TSG能够通过抑制NF-κB信号通路减轻TNF-α诱导的人脑微血管内皮细胞损伤。     

吸烟对大鼠心脏组织中PKC-α和NF-κB表达的影响

目的:研究吸烟对大鼠心脏组织中PKC-α和NF-κB表达的影响.方法:用Western blot检测对照组和吸烟大鼠心脏组织中PKC-α和NF-κB表达水平.结果:吸烟1、2、3个月后大鼠心脏组织中PKC-α和NF-κB的表达与对照组比较差异有统计学意义,而且表达水平逐渐增高(P<0.05).结论:吸烟可能通过增加PKC-α和NF-κB的表达参与对心脏的损害.     

吸烟对大鼠心脏组织中PKC-α和NF-кB表达的影响

目的:研究吸烟对大鼠心脏组织中PKC-α和NF-кB表达的影响.方法:用Western blot检测对照组和吸烟大鼠心脏组织中PKC-α和NF-кB表达水平.结果:吸烟l、2、3个月后大鼠心脏组织中PKC-α和NF-кB的表达与对照组比较差异有统计学意义,而且表达水平逐渐增高(P<0.05).结论:吸烟可能通过增加PKC-α和NF-кB的表达参与对心脏的损害.     

猪α干扰素在BHK-21细胞中的表达与生物活性分析

为了构建猪α-干扰素(PoIFN-α)的真核表达系统,鉴定其生物学活性,分离猪的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增猪α-干扰素基因序列,克隆至pcDNA3.1(+)载体,并转染BHK-21细胞。通过G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用real-time PCR及ELISA测定PoIFN-α基因在BHK-21细胞内的表达,利用淋巴细胞增值试验(MTT)检测表达蛋白的生物学活性。结果表明:稳定整合PoIFN-α基因的BHK-21细胞系其PoIFN-αmRNA的转录效率比阴性对照组提高1.52倍,蛋白表达量显著提高1.35倍。MTT试验表明真核表达PoIFN-α淋巴细胞增值活性与阴性对照组相比差异显著(P<0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIFN-α具有良好的生物学活性,为开发新型抗病毒制剂奠定基础。     

α一干扰素、异搏定协同逆转肾癌细胞药物耐受性

目的：探讨α-干扰素(α-IFN)、异搏定(VRP)对RCC-925肾癌细胞阿霉素敏感性的影响。方法：(1)将RCC-925肾癌细胞分别与不同浓度的逆转剂α-干扰素或异搏定或α-干扰素+异搏定及与不同浓度阿霉素(ADM)共同培养;MTT法检测肿瘤细胞的存活率。(2)图像分析仪检测逆转前后PgP(P-glycoprotein)表达。结果：单独应用α-干扰素无逆转作用;联合应用α-干扰素、异搏定显著逆转肿瘤细胞的耐药性,效果优于单用异搏定(P＜0．05);2．5 mg/L异搏定+500pg/mLα-干扰素共同与细胞作用后,PgP表达降低。结论：α-干扰素、异搏定作为逆转剂联合使用,能显著逆转RCC-925细胞的耐药性,可望为临床耐药肿瘤的治疗提供一种新的方法。     

改造人干扰素α2b基因在大肠杆菌中获得高效表达的理论方法

按照Ｅ．ｃｏｌｉ甚高表达基因中同义密码子使用,密码子内和密码之间碱基关联的ＥＥＮＳ模式,对人干扰素α２ｂ基因编码区中的同义密码子进行置换,理论上使得人干扰素α２ｂ基因在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达水平有非常显的提高,在理论上,未改造的人干扰素α２ｂ基因在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达水平为ＣＡＩ＝０．３２３,ＣＤＩ＝０．５７４,ＣＥＩ＝０．６２９,是较低表达水平的基因,估计实际表达水平在１０～１０＾３ｍｏｌ／ｃｅ     

抗鼠跨膜型TNF-α多克隆抗体设计和制备

目的:设计和制备区分鼠跨膜型肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和分泌型TNF-α的多克隆抗体.方法:采用抗原肽预测软件对跨膜型TNF-α表位进行预测,合成跨膜型TNF-α24个氨基酸多肽,并与匙孔碱血蓝蛋白偶联,家兔皮背部多点注射,收集分离血清,采用酶联免疫吸附试验和流式细胞术鉴定其特异性.结果:制备出高效价的抗血清,该抗血清可特异性结合免疫原多肽,不与分泌型TNF-α发生交叉反应,流式细胞术显示该抗血清可与细胞系NIH 3T3表达的跨膜型TNF-α发生特异性结合.结论:成功制备了跨膜型TNF-α特异性多克隆抗体,为区分跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α生物学作用提供了新工具.     

α—干扰素、异搏定协同逆转肾癌细胞药物耐受性

目的：α－干扰素（α－ＩＦＮ）、异博定（ＶＲＰ）对ＲＣＣ－９２５肾癌细胞阿霉素敏感性的影响。方法：（１）将ＲＣＣ－９２５肾癌细胞分别与不同浓度的逆转剂α－干扰素或异搏定或α－干扰素＋异搏定及与不同浓度阿霉素（ＡＤＭ）共同培养;ＭＴＴ法检测肿瘤细胞的存活率。（２）图像分析仪检测逆转前后ＰgP(P-glycoprotein)4表达。结果：单独应用α－干扰素无逆转作用,联合应用α－干扰素、异搏定显著逆转肿瘤细胞的耐药性,效果优于单用异搏定（Ｐ＜０．０５）;２．５mg/L异搏定＋５００pg/mLα－干扰素共同与细胞作用后,PgP表达降低。结论：α-干扰素、异搏定作为逆转剂联合使用,能显逆转RCC－925细胞的耐药性,可望为临床耐药肿瘤的治疗提供一种新的方法。     

按大肠杆菌高表达序列设计的人干扰素α-2b基因的化学合成和克隆

根据大肠杆菌高表达序列重新设计了人干扰素α-2b基因编码区的核苷酸序列,应用化学合成的方法合成了多个互补DNA片段,经互补片段分别退火和连接后,将完整编码区分两段分别克隆于pUC19质粒中,进行DNA序列分析,分别选取序列完全正确的两种克隆片段进行重组.获得了与设计序列完全一致的含有完整编码区的人干扰素α-2b基因.     

信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种新型的非常规酵母,具有生长快、分泌能力强、安全性高等优势.在酵母表达系统中,分泌信号肽不仅介导了外源蛋白沿着正确途径分泌到胞外,也在蛋白质翻译后加工等方面发挥了重要作用.本文分别研究了酿酒酵母α-Factor信号肽和克鲁维酵母菊粉酶信号肽对耐热木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中的分泌表达影响.工程菌摇瓶发酵72h后,在含有菊粉酶信号肽和α-Factor信号肽的工程菌株的发酵上清中,木聚糖酶酶活分别为318.91U/mL和117.90U/mL,表明马克斯克鲁维酵母表达木聚糖酶时,菊粉酶信号肽介导的蛋白分泌表达效果优于α-Factor信号肽.重组表达木聚糖酶最适反应条件是pH5.5和65℃,在75℃处理1h后,该酶的剩余酶活保留73%以上.在5L发酵罐中,重组菌高密度发酵72h,木聚糖酶酶活高达157 757U/mL,结果表明,马克斯克鲁维酵母表达系统在工业酶领域中应用具有非常广阔的前景.     

银屑病TNF-α及c-myc表达的变化及意义

目的 探讨银屑病的免疫机制,为银屑病的临床诊治及新药研制提供实验依据.方法 利用细胞培养技术培养HaCaT细胞,采用ELISA法检测银屑病外周血TNF-α及c-myc的表达情况以及TNF-α刺激后c-myc在银屑病HaCaT细胞中的表达情况.结果 与正常对照组比较,银屑病组外周血血清中TNF-α及c-myc的水平明显升高(P<0.01);80 ng/mL的TNF-α可刺激HaCaT细胞高分泌c-myc蛋白,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01).结论 TNF-α是通过影响c-myc的分泌在银屑病发生、发展过程中起重要作用的.     

重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白的分离纯化

考察了大肠杆菌E.coli表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程。实验结果表明：包涵体经7mol/L盐酸胍,10mmol/L DTT变性;1mol/L尿素,2mmol/L还原型谷胱甘肽,0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽脉冲加样稀释复性;金属螯合层析收集0.3mol/L咪唑洗脱峰,冷干后经重组肠激酶30℃酶切24h、Sephadex G50 柱纯化,可得到纯度达90%的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白,且最终目的融合蛋白产量达68mg/g干菌体。     

当归多糖对麻黄素小鼠肝组织抗氧化酶活性和NF-κB、TNF-α表达的影响

探讨当归多糖对麻黄素小鼠肝组织抗氧化酶活性和核转录因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的影响及其可能作用机制.小鼠连续腹腔注射4.0g·L-1麻黄素溶液,同时用当归多糖溶液(12.5,25.0g·L-1)进行灌胃,分别在5,10,15d时用分光光度法检测各组小鼠肝组织T-AOC、GSH-PX活性的变化,免疫组化法检测小鼠肝组织中NF-κB和TNF-α表达的变化.结果显示实验对照组小鼠肝组织T-AOC、GSH-PX活性明显降低(P0.01),肝组织NF-κB和TNF-α表达量显著增强(P0.05或P0.01),而当归多糖组T-AOC、GSH-PX活性与实验对照组相比显著升高,NF-κB和TNF-α表达量明显降低(P0.05或P0.01).结果表明,麻黄素影响小鼠肝组织抗氧化酶活性和NF-κB、TNF-α的表达,当归多糖能够提高小鼠肝组织抗氧化酶活性,抑制NF-κB和TNF-α的表达,对麻黄素致小鼠肝损伤有一定的保护作用.