苯硫酚对固氮酶催化活性的影响

研究了苯硫酚对棕色固氮菌固氮酶催化底物还原活性的影响．结果表明；当反应体系中固氮酶钼铁蛋白与苯硫酚的摩尔比为1:4时．固氮酶的乙炔还原活性比对照组下降了62．3％，下降的幅度随着苯硫酚浓度的升高而增大；但在乙炔存在的情况下，固氮酶的放H2活性随着苯硫酚的浓度的升高而升高．在氩气氛下，苯硫酚浓度的升高对固氮酶放H2活性的影响不明显．这一现象有可能是由于苯硫酚取代与铁钼辅基的Fe1原子连接的半胱氨酸的巯基而引起的．     

固氮酶钼铁蛋白活性辅基模拟物与缺辅基钼铁蛋白组合

随着固氮酶钼铁蛋白及其活性辅基(FeMo-CO)的研究逐渐深入,活性辅基结构的设计及模拟物的合成研究引起了国内外化学家的重视。活性辅基模拟物与缺辅基钼铁蛋白的生物组合规律研究对模拟物的定向合成、酶的半合成及固氮酶的催化机理等研究都有着重要意义。这方面研究已有一些报导,但系统研究不多。     

固氮酶固氮机理研究——Ⅰ.猪心细胞色素C与钼铁蛋白重组合

以猪心细胞色素C代替棕色固氮菌铁蛋白,与棕色固氮菌钼铁蛋白重组合,实现了氮还原成氨,乙炔还原成乙烯,以及需还原剂的ATP水解反应。猪心细胞色素C与棕色固氮菌钼铁蛋白重组合亦要求一定的比例。从差示光谱上看,猪心细胞色素C与棕色固氮菌铁蛋白在波长460mμ处都有一个共同的吸收峰。实验结果表明,钼铁蛋白本身可能就是固氮酶;而铁蛋白起着电子传递体的作用。     

化学模拟生物固氮——Ⅵ.铁钼辅基模型化合物的合成及其催化性能

本文讨论了先前我们提出的固氨酶活性中心骈联双座双立方烷原子簇结构模型的一些特征。根据这一模型。设计了铁钼辅基模型化合物的合成方案,合成了三系列的铁钼辅基模型化合物,其Mo、S~*、Fe之比如同这一模型所要求的,为1:～6:6～8。由氯化物系列和柠檬酸盐进行配位体交换而得到的柠檬酸盐系列中的两个样品,在KBH_4还原C_2H_2为C_2H_4的反应中具有很高的催化活性(按每个Mo计算,转变数为20～30分~(-1))和选择性(91～95％),接近天然的铁钼辅基的水平,并在与Av突变种UW_(45)重组后,按Shah和Brill的方法测定,显示出明显的固氮酶活性。     

化学模拟生物固氮——Ⅶ.乙炔选择性还原成乙烯作为原子簇活性中心多核络合活化底物的一种判据

系统地比较了FeMo-co和固氮酶的各种模拟体系在KBH_4还原乙炔为乙烯的反应中的催化活性和选择性。FeMo-co(活性:转变数为34;选择性:99％C_2H_4)和本实验室合成的模型化合物(活性:转变数为20～30;选择性;91～95％)比其它固氮酶的模拟体系(MoO_4~(2-)-CySH;MoO_4~(2-)—CySH—Fe~(2 );MoOS_4~(2-)—胰岛素;[Fe_4S_4(SCH_2Φ)_4]~(2-);和MoS_4~(2-))具有较高的活性和选择性;这可作为FeMo—co及其合成模拟物的原子簇活性中心多核络合活化底物分子的一种判据.     

固氮酶催化作用机理及其化学模拟

固氮酶是某些微生物在常温常压下固氮成氨的主要催化剂,其催化机理和化学模拟是国际上长期致力研究的对象。尽管人们已经揭示了固氮酶催化活性中心——铁钼辅基（FeMo-co)MoFe7S9（R-高柠檬酸）的结构,然铡,有关FeMo-co生物合成的详细途径和其中包含的钼铁转移和利用;固氮酶在哪些活性位和按什么模式结合N2,C2H2、CO等多种底物或抑制剂;以及其中涉及的电子和质子传递过程等许多问题,至今尚有待解决。本文将综述这些问题的研究进展和厦门大学固氮组最近五年来的相关研究工作。     

棕色固氮菌的氢酶初步研究

棕色固氮菌(Azotobacser Vinelandii—230)中与固氮酶共存的氢酶属于单向吸氢的氢酶,其中以粒子态存在者约占其总活力的78％,可溶态占22％。此二态酶对冷热稳定,最适反应温度和利用多种电子受体吸氢等方面均相似,但在耐热性、温度曲线的形式及对某些电子受体的亲和性方面有些差异。乙炔、Na~+离子及氧对酶的吸氢活力有抑制作用。菌体的氢酶活力,有氨培养比无氨培养的低86％左右;大量氨培养的UW—45菌体仍有氢酶活性,但比氨耗尽的UW45菌体低55％左右。钨代替钼培养的菌体无固氮酶活性,其粗提液氢酶活性也极低。由此可见,氢酶活性与固氮酶活性有极为密切的关系。     

化学模拟生物固氮——Ⅸ 铁钼辅基模型化合物的合成和性能表征

采用乙二醇基阴离子作为活插头(可通过水解除去的双配位螯形配位体),对前文提出的合成方法作了重要改进,以期所合成的铁钼辅基模型化合物中Mo~(Ⅳ(Ⅲ))第一配位界内两个不稳定的配位体处于相邻的位置,如厦门模型Ⅲ(或厦门模型Ⅱ)所要求。合成和重组活性评价结果,重组活性比使用乙腈等为活插头的提高2个数量级,化学催化活性和选择性接近于天然FeMo-co水平。     

猪心细胞色素C对固氮酶的作用

在我们早期的工作中,发现棕色固氮菌无细胞抽提物经过柱分离,得到单独没有固氮活性的钼铁蛋白部分,如果加入适当量的猪心细胞色素C时,就能表现出还原分子氮和乙炔的活性。后来的工作表明,当镏铁蛋白组分纯度提高以后,细胞色素C的作用不但没有提高,反而下降了。因此,我们对细胞色素C的作用做了进一步的分析研究。     

循环伏安法研究棕色固氮菌固氮酶组分性质

用循环伏安法研究固氮酶国内外尚未见报道。木工作在不加电子传递体的情况下,用该法研究了棕色固氮菌的钼铁蛋白(Av1)和铁蛋白(Av2)的某些性质。 所用菌株为棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)野生型菌株op或230,以及不能合成FeMoco的缺陷型菌株UW-45。Av1和AV2的分离、纯化及活性如前文所述。 循环伏安法采用叁电极系统,及前文所述仪器,在-590到470mV内进行扫描,     

某些合成铁钼原子簇化合物对乙炔选择性还原为乙烯的催化活性

本文采用恒压反应器,考察了某些合成铁钼原子簇化合物对乙炔选择性还原为乙烯的催化话性,并对它们的催化话性与某些实验条件的关系进行了讨论。 实验结果表明: 1.含钼2.23％(重量)的L806,模型化合物是所有试验晶体中活性最高者,其乙烯初始转化数为0.989,各摸型物的选择性均不小于90％。 2.经乙炔预接触处理,模型化合物的话性可提高一个数量级。 3.模型物同时具有使DMSO被KBH_4还原产生甲烷的催化活性。     

棕色固氮菌钼铁蛋白的结晶及其氧化还原电位的研究

本文叙述棕色固氮菌固氮酶钼铁旦白的分离和结晶方法。降低固氮酶提取液的离子强度,可获稠密的暗棕色钼铁旦白结晶。钼铁旦白的晶体为针状。其比活性为1643毫微克分子乙烯形成分钟毫克旦白。用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,重结晶的钼铁旦白达均一的纯度。 结晶纯的钼铁旦白用染料平衡法测定,其氧化还原电位为-54mV,每个钼铁旦白分子传递电子数(n)为3.9～4。此电位对比固氮过程中的Fd和固氮酶的铁旦白来说是太正;然而它与半还原态变为氧化态的钼铁旦白的电位值基本是一致的。     

固定化棕色固氮菌的固氮酶活性

比较了用海藻酸钠、琼脂、聚丙烯酰胺、K-卡拉胶和明胶包埋法及DEAE-纤维素吸附法固定化的固氮菌的乙炔还原活性,表明海藻酸钠包埋的菌体固氮酶的活性最高、持续时间也最长,琼脂包埋的次之.菌体悬液(10~(20)/ml)与海藻酸钠(4％)的配比以1:5为佳。其固定化菌体的乙炔还原活性的最适pH为7.5,最适温度为32℃,Km为20μM,活化能为10.29kcal/mol,Vmax为14.2μM.丙二酸,2,4-二硝基酚,叠氮化钠,磺基水杨酸,硫酸铵,硝酸钾,高浓度亚硝酸钠有抑制作用,而低浓度亚硝酸钠有刺激作用,CO_2对其乙炔还原和放氢有抑制作用,CO对其放氢无抑制作用.其乙炔还原的最适氧分压为10kPa.     

棕色固氮菌钼铁蛋白的分子量及钼铁含量

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的分子量有一些报导见表4,但存在着严重分歧,至今仍未统一,影响结构研究工作进展。我们用凝胶过滤法对二次结晶钼铁蛋白和二次柱分离钼铁蛋白(二者均为圆盘电泳均一,比活性在1000毫微克分子/分毫克蛋白以上)进行了分子量测定工作。测定结果,分子量为225000。     

固氮酶活性中心模型和铁钼辅基模拟体合成的研究进展

前阶段(1973—1976),我校蔡启瑞教授以固氮酶的十来种底物作为化学探针,并根据络合催化原理,直接推断N≡N,n—R—C≡N,n—R—N≡C,n—R—C≡CH等固氮酶的底物分子是按μ_3(η~2)方式配位络合在三核活性中心上的(但从当时已知的科学实验,尚未能确断活性中心究竟含一个或两个钼),并进一步推断两个这样的三核活性中心通过共用钼而骈联在一起,成为骈联双座的结构,从而提出了第一个立方烷原子簇结构的固氮酶活性中心模型。1977—1978年,又进行了两次演进,于1978年7月首先提出钼上不含有机硫配位体的骈联双座双立方烷的固氮酶活性中心模型,即“厦门模—Ⅲ型”[S Fe_3S_2(L)]Mo[(L′)S_2Fe_3S]。其中L和L′代表两个活动的配位体。这模型能较好地说明许多实验事实,并为合成铁钼辅基模拟体指出了方向(上述这一模型和“厦门模型—Ⅱ”、“福州模型—Ⅱ”的关系,详见文献[2]b和[3])。     

固氮酶铁钼辅基模拟物中无机硫含量的测定

本文提出测定铁钼辅基模拟物中无机硫含量的测定方法。样品用溴处理使无机硫定量氧化为硫酸根,后加铬酸钡使析出等当量铬酸根,用分光光度法测定。分析方法简易快速,精密度和准确度均优。     

电位处理对棕色固氮菌整体细胞固氮活力的影响

用电化学综合测试仪调控电位,研究了棕色固氮菌整体细胞氧化还原性质。结果表明:电处理的菌体电位在-800 mV～ 500 mV(相对于饱和甘汞电极电位)之内,菌体的固氮活力均高于未处理的细胞,其中在-400 mV 和-600 mV 处理的,其同氮活力分别增高78％和70％。用控电位法测定了棕色固氮菌整体细胞活性氧化还原电位为 E′_AOR=-645mV和E″_AOR= 566 mV。     

关于固氮酶的作用机理和活性中心結構

本文根据固氮酶已知的反应和络合催化原理,讨论了固氮酶的作用机理和活性中心结构;提出了由Fe_2S_2·Mo_2O_2原子簇构成的两个偶联在一起的两钼一铁三核活性中心(2 Mo—1 Fe)的看法;这两个偶联的三核活性中心也是放氢的活性中心.根据这活性中心模型,说明了各种底物分子的还原反应机理和CO只抑制分子氮、炔类、腈类、异腈类等6π-配位体型的底物分子的还原反应,而不抑制放氢反应的原因,以及ATP的作用机理和ATP/2比值与电子倒流的关系.     

棕色固氮菌固氮酶氧化还原性质的研究

用染料分光滴定法、控制电位电量法及阶跃电量法研究了棕色固氮菌(AV)固氮酶其及组份的氧化还原性质.Av2的Em=-265±22mV,传递电子数为1;结合MgATP后,Em=-378±20mV,传递2个电子,结合MgADP后,Em=-326mV.Av1-Av2复合物结合MgATP后,有Em为-290mV和-452mV的两个氧还区,分别传递6.5个和5.1个电子.     

钌—卟啉氮分子配合物的合成(简报)

自从1965年加拿大化学家Allen A D第一次合成了钌的氮分子配合物[Ru(NH_3)_5N_2]X_2(X=卤离子、BF_4~-、PF_6~-等)以来,氮分子配合物的研究引起人们广泛的兴趣。人们希望,通过氮分子配合物的研究,弄清生物固氮过程中固氮酶体系的催化机制,寻找合成氮的新型催化剂,逐步实现化学模拟生物固氮,最终有可能在常温常压下合成氮。20多年来,合成氮分子配合物的研究工作有了很大的发展。已发现许多过渡金属都能生成氮分子配合物。在这些配合物中,其它配体还可以是多种多样的,如卤离子、水、氨、负氢离子、取代膦、羰基、环戊二烯基等但含有卟啉环配体的氮分子配合物尚较少见。