泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶基因克隆及在酒精酵母中的表达与分泌

<正>泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的葡萄糖淀粉酶是一种诱导的糖蛋白,它具α-1,4和α-1,6-D-glucan glucohydrolase活性,广泛用于需糖化淀粉的工艺.若将该酶基因导入啤酒酵母,构建能直接利用淀粉的酵母工程菌株,可省去淀粉液化和糖化的过程.国际上已有将泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶导入啤酒酵母的报道.该酶作用最适温度为60℃,对食用乙醇生产工艺较为有利.因此,我们用RT-PCR技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因,将其置于酵母烯酸酶(Enolase)启动子(Promotor)和终止子(Terminator)之间,构建了表达载体,转化非营养缺陷型酒精酵母AS.2.1364,获得能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株.     

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶基因克隆及在酒精酵母中的表达与分泌

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的葡萄糖淀粉酶是一种诱导的糖蛋白,它具α-1,4和α-1,6-D-glucan glucohydrolase活性,广泛用于需糖化淀粉的工艺.若将该酶基因导入啤酒酵母,构建能直接利用淀粉的酵母工程菌株,可省去淀粉液化和糖化的过程.国际上已有将泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶导入啤酒酵母的报道.该酶作用最适温度为60℃,对食用乙醇生产工艺较为有利.因此,我们用RT-PCR技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因,将其置于酵母烯酸酶(Enolase)启动子(Promotor)和终止子(Terminator)之间,构建了表达载体,转化非营养缺陷型酒精酵母AS.2.1364,获得能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株.1 材料与方法(1)菌种及培养基 泡盛曲霉(Aspeergillus awamori)NMRL3112,葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因供体,采用文献的培养基;酒精酵母(Sacchromyces cerevisiae)AS.2.1364为葡萄糖淀粉酶基因受体,采用YPD培养基;转化酵母采用YPDS培养基,含1%葡萄糖和1%可溶性淀粉.大肠杆菌TG1作为pAC1(由刘宏迪保存)及测序质粒pGEM-3zf( )的宿主菌,采用LB培养基,氨卞青霉素抗性.     

酵母系统用于外源蛋白的商业性生产

酵母是进行外源蛋白生产的很有吸引力的寄主。与原核系统不同,酵母具有真核亚细胞组织,能完成译后的各种折叠、加工和修饰过程,通过这些过程才能产生出“真实的”、有生物活性的哺乳动物蛋白。另外,它们还具有单细胞微生物的生长快速和遗传操作简便的优点。酵母表达工作的极大部分集中在已经充分研究过的酿酒酵母(Sacharomyes cerevisae)上。然而,随着DNA转化技术的发展,越来越多的非酿酒酵母正在成为生产重组多肽的宿主,其中包括:多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、西方许旺酵母(Schwanniomyces Occidentalis)和解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)。本文将综述以上替代酿酒酵母的酵母表达系统的性能,并讨论其优缺点。     

用纸上层析法判定糖发酵鉴定酵母的试验

苏联库德里亞夫采夫提出用“简单糊精”的發酵作用来区分酵母种別的主張,是一項值得重視的意見,因为这种方法簡便地將兩种酵母——葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)和啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)——明显地分为兩个种,而过去权威的荷蘭酵母分类学家婁德(Lodder)等都是把葡萄酒酵母列为啤酒酵母的一个     

利用细胞自溶法提取酵母蛋白

饲料掺入饲料酵母,对禽畜生长大有益处。但是酵母细胞中的蛋白质还是下能全部被禽畜吸收,因为许多酵母细胞没有降解。最近,苏联科学院微生物学研究所和苏联生物工业部全苏生物工艺科学研究所(莫斯科)研究出用细胞的自身“力量”提取酵母蛋白的方法,使饲料蛋白得到更充分的利用。这种方法的根据是自溶     

两种拮抗菌β-1, 3-葡聚糖酶和几丁酶的产生及其抑菌的可能机理

膜醭毕赤酵母（Pichia membranefaciens Hansen)和季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii)是两株能有效抑制桃、油桃果实采后软腐病的拮抗菌。研究了拮抗菌的β－1,3－葡聚糖和几丁酶活性在in vitro和in vivo上的诱导。结果表明,以葡萄糖＋细胞壁制品（CWP）作为碳源时在Lilly-Barnett基本培养基中诱导的β－1,3－葡聚糖活性最高,其中膜醭毕赤酵母和季也蒙假丝酵母的最高值分别达114.0 SU(specific activity unit,比活单位）和103.2SU,而以葡萄糖作为惟一碳源时诱导的β－1,3－葡聚糖活性则最低。在Czapeck基本培养基中,膜醭毕赤酵母诱导的几丁酶（外切及内切几丁酶）活性显著地高于季也蒙假丝酵母,如膜醭毕赤酵母外切几丁酶最大活性达3.13SU,显著地高于季也蒙假丝酵母的最大活性（2.24SU)。酵母菌悬浮液和碳源也能诱导桃果实伤口处β－1,3－葡聚糖和几丁酶的产生。研究表明β－1,3－葡聚糖和几丁酶在抑制病菌时都有一定作用,并可能具有协同效果。     

疫苗的革命

疫苗的发明者英国医生詹纳首次把天花患者的脓液直接接种到健康人的身体上。其后,人们便将灭活了的毒素或死了细菌、病毒作为疫苗而采用。最近,疫苗开发的技术进步——疫苗革命是特别值得谈的。新技术之一是采用只让大肠杆菌或酵母制造病毒蛋白质,即利用大肠杆菌或酵母的方法。采用该法时,由于利用基因操作可以把多种病毒蛋白质合而为一,因此用一次接种便可产生对多种疾病的免     

神奇的酵母,科学的宠儿

酵母是一种单细胞真核生物,基于自身诸多优势而成为生物化学、遗传学和细胞生物学的重要研究模型。借助酵母无细胞体系阐明了酶的功能、酶的构成、辅酶特性、tRNA结构和真核转录机制等。酵母作为模式生物在细胞周期、囊泡运输、细胞自噬、端粒保护、蛋白质折叠、未折叠蛋白应答、DNA损伤应答、雷帕霉素靶点和组蛋白调节等重大发现中做出了根本性贡献。许多科学家也因此荣获诺贝尔奖。本文全面介绍酵母在科研中的应用价值。     

酵母双杂交技术构建重组维甲酸X受体(RXR)基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组维甲酸X受体(RXR)基因酵母, 用以筛选具有类/抗维甲酸活性的化合物. 构建含有RXR基因的酵母表达质粒pGBT9-RXRβ, 称为诱饵质粒; 构建含有RXR协同激活因子GRIP1基因的酵母表达质粒, 形成靶质粒pGAD424-GRIP1; 诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187, 于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落, 构建RXR-GRIP1双杂交酵母. 考察RXRβ-GRIP1酵母与典型的RXR配体化合物天然激素-9-顺维甲酸的结合情况. 结果表明, 9-顺维甲酸能够诱导RXRβ-GRIP1酵母酶活性, 并存在显著的剂量-效应关系, EC₅₀值为1.5×10^-7 mol·L^-1. 构建的 RXRβ-GRIP1 酵母与报道的RXRβ- TIF2酵母相比, 对9-顺维甲酸的EC₅₀值接近, 但诱导活性较高. 进一步建立了检测环境污染物诱导/抑制RXRβ-GRIP1酵母β-半乳糖苷酶活性的实验方法, 用于检测三丁基锡乙酸盐化合物、Aroclor1254以及水厂进水和出水样品. 证明三丁基锡乙酸盐能够较强地诱导RXRβ-GRIP1酵母酶活性; 而Aroclor1254能够显著抑制9-顺维甲酸诱导的RXR酶活性, 是RXR拮抗剂; 水厂进水样品能够抑制9-顺维甲酸诱导的酶活性, 而现行工艺对RXR拮抗剂有很好的去除效果. 证实了该重组基因酵母用于环境污染物类/抗维甲酸干扰效应的筛选可行性.     

两种拮抗菌β-1,3-葡聚糖酶和几丁酶的产生及其抑菌的可能机理

膜醭毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｍｂｒａｎｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｈａｎｓｅｎ）和季也蒙假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）是两株能有效抑制桃、油桃果实采后软腐病的拮抗菌．研究了拮抗菌的β－１,３－葡聚糖和几丁酶活性在ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　和ｉｎ　ｖｉｖｏ上的诱导．结果表明,以葡萄糖＋细胞壁制品（ＣＷＰ）作为碳源时在Ｌｉｌｌｙ－Ｂａｒｎｅｔｔ基本培养基中诱导的（　－１,３－葡聚糖活性最高,其中膜醭毕赤酵母和季也蒙假丝酵母的最高值分别达１１４．０　ＳＵ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｕｎｉｔ,　比活单位）和１０３．２　ＳＵ,而以葡萄糖作为惟一碳源时诱导的β－１,３－葡聚糖活性则最低．在Ｃｚａｐｅｃｋ　基本培养基中,膜醭毕赤酵母诱导的几丁酶（外切及内切几丁酶）活性显著地高于季也蒙假丝酵母,如膜醭毕赤酵母外切几丁酶最大活性达３．１３　ＳＵ,显著地高于季也蒙假丝酵母的最大活性（２．２４　ＳＵ）．酵母菌悬浮液和碳源也能诱导桃果实伤口处β－１,３－葡聚糖和几丁酶的产生．研究表明β－１,３－葡聚糖和几丁酶在抑制病菌时都有一定作用,并可能具有协同效果．     

人类细胞分裂周期基因CDC2H克隆的筛选

细胞分裂周期基因(Cell division cycle gene,CDC基因)的概念最早是从酵母遗传学研究中提出的,迄今已分离出40多种酵母CDC基因.其中最令人感兴趣的是从裂殖酵母S.pombe中分离的cdc 2基因,它从酵母到人具有高度的进化保守性.在酵母的细胞周期中,     

水稻减数分裂相关基因OsDMC1的克隆

酵母DMC1基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的减数分裂特异基因,其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的,根据在酵母Dmc1与拟南芥AtDmcl中保守的氨基酸motifs合成的简并性引物,以cDNA作模板,通过套式PCR（nested PCR）和RACEs克隆了水稻中酵母DMC1的同源基因OsDMC1,OsDMC1全长的cDNA是1348bp,编码344个氨基酸组成的多肽（OsDmcl）,OsDmcl与Dmcl和AtDmcl的氨基酸序列一致性分别是51．8％和81．7％,OsMDC1在生殖器官中表达量较高,在根中有少量表达,而在叶和幼芽中不表达,Southern blot分析结果表明水稻基因组中有两个拷贝的OsDMC1。     

葡萄糖耐量因子生物活性测定中存在的问题

根据前人的工作,认为三价铬是萄葡糖耐量因子(GTF)的必须成分,啤酒酵母富含GTF。1967年Mertz发现啤酒酵母发酵时,加入酵母提取物能极大地促进其CO_2释放速度,1980年Mirsky和1982年Haylock进一步证实了这种作用,并以酵母发酵过程中二氧化碳释放速度增长率的大小来衡量GTF的生物活性,据此认为GTF是啤酒酵母发酵     

两株掷孢酵母所生Biotin的鉴定

在我们测验一种酵母属菌(2.346号 Saccharo-myces)的单倍体及双倍体所需要生长素是否一致时,见到一个小菌落能生多量的生长素。经过分离后,得到四种菌:两株掷孢酵母(Sporobolomyces),一株霉菌及一株普通酵母,前三者均能合成生长素(图1)。我们近来用生长图形法(Auxanographic me-thod)研究酵母生长素的经验,认为这个方法比我们以前所用的重量法、计数法、发酵法、美蓝还原法等简便得多;已经用这个方法测验出不少酵母     

带脱氧反密码子的酵母丙氨酸tRNA类似物失去了它的掺入活力

在另一篇文章中,我们已经证明酵母丙氨酸tRNA接受茎中某些2′-羟基对于该tRNA与氨酰tRNA合成酶的识别是重要的。本文希望探讨酵母丙氨酸tRNA反密码子中的核糖的功能。我们以前的研究证明,酵母丙氨酸tRNA反密码环并不参与tRNA与合成酶的相互作用。因此可以用脱氧核糖核苷酸取代tRNA的反密码子而不用担心接受活力的丧失。我们的研究也证明了具有GGC(天然的为IGC)密码子的类似物具有非常高的将它携带     

6个植物MARs序列的ARS功能鉴定与分析

利用酵母表达系统, 对来自烟草和拟南芥的6个植物MARs序列分别进行了ARS功能鉴定. 结果表明, 在酵母细胞内, TM1和AM4有强的自主复制功能, 其活性与来自酵母染色体的ARS相当, 其他4个植物MARs序列无ARS活性. 为了进一步分析植物MAR序列中ARS的活性区, 利用PCR方法对TM1和AM4进行亚克隆, 相应的亚克隆分别命名为TM1-1, TM1-2, TM1-3, AM4-1, AM4-2和AM4-3. 实验发现, TM1-3和AM4-3不仅具有比完整MARs更高的ARS活性, 而且在酵母转化效率、转化稳定性及生长速度方面也优于完整片段. 本研究结果为阐明MAR的作用机制与自主复制功能的关系提供了重要线索.     

纪念碑的杀手

纪念碑的杀手酸雨以及其它类型的污染能够破坏古代的纪念碑，但是像黑色酵母真菌这样的微生物可能是一种更大的威胁．两年以前，德国奥登堡大学的沃尔夫岗·Ｅ·克鲁贝发现黑色酵母真菌产生的酸性化合物正在将巴台农神庙和位于地中海附近的其它古代纪念碑的表面逐渐吞噬掉...     

蛋白复合物与相互作用谱和表达谱的相关性分析

蛋白相互作用是指细胞内蛋白-蛋白间的物理相互作用, 通过酵母双杂交系统和基于质谱的蛋白吸附沉淀技术, 在酵母细胞中获得了大规模的蛋白相互作用数据. 收集了文献报道的共2617个酵母蛋白的11855条相互作用. 通过分析酵母细胞的大规模基因表达谱数据, 获得不同基因间表达的相关性. 蛋白复合物数据也可以获得, 并能转换成蛋白两两关系数据. 综合分析蛋白复合物、蛋白相互作用数据和基因表达数据可以发现三者之间的相关性. 结果显示, 有相互作用或表达谱相似的蛋白都比随机抽取的蛋白同属一蛋白复合物的几率高; 并且, 有相互作用且表达谱相似的蛋白同属一蛋白复合物的几率更高. 这一研究表明, 对现有的大规模蛋白复合物数据、蛋白相互作用数据和基因表达谱数据进行整合、分析, 可以揭示它们之间的关联性, 并且有助于获得这些数据蕴含的公共信息. 这种研究方法对于其他的大规模数据, 如蛋白组数据、表达谱数据、蛋白的细胞定位数据和表型数据的综合分析有很好的借鉴意义.     

利用毕赤酵母表达抗真菌鲎素基因

人工设计并合成了抗真菌鲎素基因ｔａｃ。将该基因克隆到酵母表达载体ｐＰＩＣ９上,使其准确融合了α交配因子分泌信号之后,电击转化毕赤酵母宿主菌ＧＳ１１５／Ｈｉｓ＾－,筛选出的转化子用甲醇作诱导物在３０℃进行诱导后,分泌到培养基中的表达产物能够抑制稻瘟病菌孢子的萌发,ｔａｃ基因以单拷贝整合到毕赤酵母染色体基因组中并有转录产物ｍＲＮＡ的存在。     

水稻减数分裂相关基因OsDMC1的克隆

酵母ＤＭＣ１基因是一个在减数分裂前期 Ｉ表达的减数分裂特异基因,其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的．根据在酵母Ｄｍｃ１与拟南芥ＡｔＤｍｃ１中保守的氨基酸ｍｏｔｉｆｓ合成的简并性引物,以ｃＤＮＡ作模板,通过套式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）和ＲＡＣＥｓ克隆了水稻中酵母ＤＭＣ１的同源基因 ＯｓＤＭＣ１．ＯｓＤＭＣ１全长的 ｃＤＮＡ是 １３４８ ｂｐ,编码 ３４４个氨基酸组成的多肽（ＯｓＤｍｃ１）． ＯｓＤｍｃ１与 Ｄｍｃ１和ＡｔＤｍｃ１的氨基酸序列一致性分别是５１．８％和８１．７％．ＯｓＤＭＣ１在生殖器官中表达量较高,在根中有少量表达,而在叶和幼芽中不表达． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果表明水稻基因组中有两个拷贝的 ＯｓＤＭＣ１．