大肠杆菌氨基转移酶的非天然氨基酸底物特异性研究

氨基转移酶催化L-氨基酸和α-酮酸之间的氨基转移.TLC(薄层层析)和甲臜颜色反应检测大肠杆菌4种氨基转移酶(TyrAT、IlvAT、AspAT和AvtAT)催化6种非天然氨基酸的转氨活性,发现AvtAT和AspAT无非天然氨基酸转氨活性.TyrAT能催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正缬氨酸的转氨反应,而Ilv...     

草鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究

通过DEAE-Sephacel离子交换层析、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析和Phenyl Sepharose 6-Fast Flow疏水层析,从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌肉中分离纯化得到了一种亮氨酸氨肽酶,并对其生物化学性质进行了研究.结果表明,草鱼肌肉亮氨酸氨肽酶分子量约为105 ku,是单体结构.最适温度为40 ℃,最适pH为7.5,属于金属蛋白酶.除了Leu-MCA,该酶对其它多种荧光合成底物也有一定程度的分解作用,但对内肽酶对应的荧光底物则没有分解作用.     

农药靶标乙酰胆碱酯酶的分离纯化及性质研究

采用了Sephadex G-25层析,DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析,对家蚕头部粗酶匀浆液中的乙酰胆碱酯酶进行纯化,得到的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和SDS-PAGE检测均为一条带,用SDS-PAGE法测得其分子量为77.8 kDa.酶的最适反应温度为37 ℃,最适pH为7.5,对底物碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)的Km值为0.392 mmol/L,最适底物浓度为1.6 mmol/L,在1.6 mmol/L底物浓度以上观察     

朊圆酵母Y0401尿酸酶的基本特性研究

研究了尿酸酶分离纯化条件和pH、温度、底物浓度、一些有机和无机试剂对尿酸酶酶促反应速度的影响.研究结果表明,用Triton X-100及巯基乙醇处理细胞悬液(pH 8.5),再用超声波处理破碎细胞效果最佳.硫酸铵沉淀尿酸酶的最佳浓度为75%.用Phenyl-Sepharose CL-4B疏水层析和Xanthine-agarose亲和层析两步纯化步骤可获得理想纯度的酶制剂.在一定的条件下,尿酸酶的最适pH和酸碱稳定pH范围分别为8.5和5.0～12.最适温度为37℃;热稳定性较好,在50℃处理30 min时活性保持90%,在60℃处理30min时活性仍保持80%.在最适条件下,该酶催化尿酸的米氏常数(Km)为3.34×10-5mol/L.一些金属离子和有机化合物对酶活性的影响也进行了研究.     

新型手性卟啉的制备与识别

利用四苯基卟啉meso位的可调性合成一种新型不对称卟啉, 通过酯键连接叔丁氧羰基(BOC)保护的L-苯丙氨酸(L-BOC-Phen-OH)而使卟啉具有手性识别的能力, 并研究了该手性卟啉对L-丙氨酸甲酯和D-丙氨酸甲酯分子识别能力的不同. 结果表明, 该手性卟啉对D-型氨基酸甲酯的识别能力较强.     

酿酒酵母中D-(-)-扁桃酸脱氢酶性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析、Butyl Sepharose疏水层析和Blue Sepharose亲和层析等分离方法,从高产D-(-)-扁桃酸的酵母菌株BY1.1b中纯化得到电泳纯的D-(-)-扁桃酸脱氢酶.采用Sephacryl S-200分子筛层析柱测得该酶的相对分子质量约60 kDa,用SDS-PAGE电泳测得该酶亚基分子量为32 kDa,表明该酶属于同型二聚体.该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0.该酶在低于30℃,pH5.5~8.0较为稳定.以NADH和苯乙酮酸为底物,其Km值分别为Km(NADH)=99.2μmol/L和Km(苯乙酮酸)=263.3μmol/L.     

新氨基酸螯合钙制剂L-亮氨酸钙的急性毒性及致突变性

研究自制的新型氨基酸螯合钙制剂--L-亮氨酸钙的急性毒性及致突变性,并对其安全性进行评价.对小鼠分别给予不同质量的L-亮氨酸钙混悬液灌胃, 连续7 d观察小鼠急性毒性.将50只小鼠随机分为5组:阴性对照组、质量比为0.04 g·kg-1的环磷酰胺组,以及质量比分别为0.5,2.5,5.0 g·kg-1的L-亮氨酸钙混悬液组通过染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验,观察L-亮氨酸钙的遗传毒性.结果表明,为小鼠灌胃7 d后半数致死计量(LD50)大于10 g ·kg-1,L-亮氨酸钙属实际无毒物质在染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验中均呈阴性反应,未显示致突变作用,表明L-亮氨酸钙无毒性和无致突变性.     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

应用于粉刺治疗的植物单体5α-还原酶抑制剂活性筛选

建立一种简单的5α-还原酶抑制剂体外筛选模型, 用于20种植物单体物质的5α-还原酶抑制活性检测, 以寻求对粉刺治疗有效的药物. 以睾酮为底物、NADPH为供氢体, 对5α-还原酶体外测定体系进行了优化, 并测定了20种中草药标准品的5α-还原酶抑制活性. 确定了5α-还原酶反应的最适底物浓度为25 μmol/L, 最适反应温度为37 ℃, 最适反应pH值为6.5. 确定了知母总苷、连翘素、蛇麻酮对5α-还原酶有抑制作用, 其半数抑制常数(IC50)分别为12.4、20.8和45.6 μg/mL. 知母皂、连翘素和蛇麻酮在抗粉刺领域具有潜在应用价值.     

朊圆酵母尿酸酶的基本特性研究

研究了尿酸酶分离纯化条件和pH、温度、底物浓度、一些有机和无机试剂对尿酸酶酶促反应速度的影响.研究结果表明,用Triton X-100及巯基乙醇处理细胞悬液(pH 8.5),再用超声波处理破碎细胞效果最佳.硫酸铵沉淀尿酸酶的最佳浓度为75%.用Phenyl-Sepharose CL-4B疏水层析和Xanthine-agarose亲和层析两步纯化步骤可获得理想纯度的酶制剂.在一定的条件下,尿酸酶的最适pH和酸碱稳定pH范围分别为8.5和5.0~12.最适温度为37℃;热稳定性较好,在50℃处理30 min时     

微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化

对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21（DE3）进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE电泳分析.结果表明：谷氨酰胺转胺酶在28℃,添加乳糖为1.2g/L诱导18 h,pH为7.0,培养11.5 h时升温至50℃诱导1 h,再放至28℃培养,表达效果较好,超过IPTG诱导效果.纯化后酶活为7.5 U/mL,比活力为10.9 U/mg.     

组氨酸标签木聚糖酶的构建表达和酶特性鉴定

通过改变终止密码子位点,在一个耐热木聚糖酶突变株DSB的C末端添加了6聚组氨酸标签(His-tag),并完成了表达和酶特性鉴定.通过PCR将嗜热真菌DSM 10635来源的木聚糖酶突变体基因dsb的终止密码子序列定点突变为谷氨酸密码子序列,连接到表达载体pET-22b(+),转化Escherichia coli.BL21(DE3),诱导表达的耐热木聚糖酶DSB在C端含有6×His-tag.表达产物经硫酸铵分级沉淀和Ni Sepharose层析纯化,获得了电泳纯重组酶DSB.结果表明:添加组氨酸标签的酶与原始酶相比,酶学特性无变化.SDS-PAGE电泳结果显示该酶分子量约为23 kDa,重组酶最适pH为6.5,最适温度为75℃,在pH 5¹0具有良好的稳定性,在pH 6.5,70℃条件下处理30min相对酶活力仍保留80%以上.     

结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及活性

以结核分枝杆菌H₃₇Rv基因为模板, PCR反应扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因（ICL）, 将其克隆入原核表达载体pET28b中, 并将pET28b I
CL转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达. 结果表明, ICL蛋白的最佳诱导表达条件为: 温度20 ℃, IPTG终浓度为025 mmol/L, 诱导表达4 h, 在此条件下 ICL实现了高效表达, 以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化ICL蛋白, 纯化程度较高. 酶学性质鉴定表明, 实验获得了具有生物学活性的重组蛋白, 重组ICL的比活力为24 μmol/(mg·min).     

重组人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白的可溶性表达、纯化和对肿瘤细胞的抑制活性

以人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A衍生物（GnRH-PE39KDEL）为研究对象,根据大肠杆菌密码子偏好性优化,通过基因合成的方法获得重组蛋白核酸序列,连接至pET-24b载体中,并转化入大肠杆菌BL21 (DE3)及BL21 ( DE3) plyS中进行诱导表达。结果显示,在含有2 mg/mL葡萄糖的LB培养基中37 ℃培养至OD-600约为0.6 h,加入0.2 mmol/L IPTG在30 ℃诱导2 h后,重组蛋白可以实现可溶性高表达。工程菌经超声波破碎、高速离心后,经镍柱纯化和脱盐后得到重组蛋白,蛋白纯度达到95 %以上,蛋白最终得率在2.6 mg/g菌体。重组蛋白经IC-50检测,可以较好地抑制肿瘤细胞株的生长。     

亮氨酸拉链结构蛋白在大肠杆菌重组子中的表达

酵母转录因子GCN4是通过亮氨酸拉链(bZIP)结构结合DNA的蛋白质之一，当GCN4二聚体与DNA结合时，亮氨酸拉链区的2个单体结合为平行的卷曲螺旋结构，而其基区由无规线团结构变为α螺旋．为探讨亮氨酸拉链蛋白与DNA的结合机理，设计了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA的必需氨基酸的折叠片段，并将其克隆到Escherichia coli BL21，讨论了此亮氨酸拉链蛋白的表达条件．在蛋白质的小量表达试验中，重组子Escherichia coli BL21于5mL含有50μg／mL氨节青霉素和34μg／mL氯霉素的LB液体培养基中培养至对数期，加入不同浓度的IPTG，继续培养以诱导蛋白质的表达，在不同的时间(如：诱导前，诱导2，4，6，8h)取样100μL到1．5mL离心管中、离心收集沉淀，将沉淀悬浮于样品缓冲液中，用10％SDS-PAGE检测；在10L含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中进行了大量表达，根据小量表达的试验结果确定了IPTG的浓度和诱导时间．结果表明：含有这种拉链蛋白质的重组子Escherichia coli BL21在37℃下小量培养时，0．1-0．8mmol的IPTG均可在2-10h内诱导该蛋白质表达；而大量培养时，0．2mmol和0．4mmol的IPTG在37℃均不可能诱导表达，只在28℃时才表达；小量培养和大量培养的最佳诱导时间为4-6h，诱导剂IPTG的浓度为0．2mmol，大量表达的温度为28℃而不是37℃．     

鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的生物学活性

为了通过细菌低温保护实验测定鱼源Ⅲ型抗冻蛋白（AFPⅢ）对大肠杆菌的低温保护效果,利用前期构建的原核表达质粒pET32a（＋）-AFPⅢ转化大肠杆菌,目的蛋白以融合his标签的形式在大肠杆菌中表达,经NI柱亲和层析得到较高纯度的AFPⅢ-his融合蛋白。细菌抗冻实验的结果表明,外加一定浓度范围内的纯化的AFPⅢ融合蛋白对细菌有明显保护作用,但是抗冻蛋白的浓度对细菌的保护力不成一致的线性关系。鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的浓度在50μg／mL时抗冻效果最好,并且随着温度的下降,抗冻蛋白对细菌的保护能力与Glycerol对细菌的保护能力的差距逐渐减少,在-80℃时基本可以代替甘油用于菌种保存。     

嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3蛋白酶基因的原核表达、纯化和性质表征

将来源于嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的蛋白酶(PH1704)基因在大肠杆菌BLP-CodonPlus中高效表达.采用超声、热失活和HiTrap Q Sepharose柱层析等方法对产物进行分离纯化.通过SDS-PAGE,Native-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,发现该重组酶以十二聚体为主的寡聚体形式存在,并具有SDS抗性.蛋白酶活力染色表明,其六聚体以上有活力.以azo-gelation为底物,对其酶学性质进行初步研究表明,其最适温度为85℃,最适pH=8.0,并且具有良好的热稳定性.     

重组锰超氧化物歧化酶工程菌摇瓶发酵条件的优化

通过单因素试验对重组锰超氧化物歧化酶(Recombinant Manganese Superoxide Dismutase,rMn-SOD)工程菌的摇瓶发酵的培养基(碳源、氮源、无机盐)和培养条件(接种量、乳糖浓度、时间、温度、摇床转速、pH值等)进行了初步优化.结果表明,工程菌发酵的优化培养基组分(质量分数)为:1.5%蛋白胨、1.5%酵母提取物、1.0%NaCl、0.4%KH2PO4、0.8%K2HPO4、1.5%(体积分数)甘油、0.2%NH4Cl和5 mmol/L MnCl2.乳糖诱导表达的优化条件为:以5%接种量培养5 h后,加入质量分数为0.25%的乳糖进行诱导表达6 h.当发酵温度为37℃、摇床转速为180 r/min、培养基的初始pH值为7.0时,表达的rMn-SOD的酶活力高.在优化条件下,工程菌的SOD活性达1 969.9 U/mL,比活力达1 081.8 U/mg.     

扁豆几丁质酶基因的克隆及表达

以扁豆总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增到长度为885 bp的扁豆几丁质酶基因cDNA,其编码294个氨基酸,目的蛋白的分子量为28.429 kDa.以该基因构建pET-21a-chi表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.30℃下,用0.1 mmol.L-1IPTG,诱导5 h,表达产物的酶活力为36.25 U.mL-1.通过常压Sephadex G-50凝胶过滤色谱,DEAE-650C常压与高效离子交换色谱对表达产物进行纯化.目标蛋白达到电泳纯(SDS电泳一条带),几丁质酶的比活力108.42 U.mg-1.表达的蛋白质产物主要以可溶性形式存在.     

嗜热菌Thermaerobacter subterraneus DSM13965磷酸三酯酶的原核表达、 ]纯化及性质表征

将来源于嗜热菌Thermaerobacter subterraneus DSM13965的磷酸三酯酶基因在大肠杆菌BL21中高效表达, 并采用超声、 热失活和组氨酸标签
镍柱对产物进行分离纯化, 通过SDS PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定. 结果表明: 该重组酶以二聚体的寡聚体形式存在; 其最适温度为70 ℃, 最适pH=10.0, 具有良好的热稳定性.