靶向沉默人HER2/neu基因的RNA干扰

针对人HER2/neu基因的mRNA序列, 设计并构建shRNA干扰载体, 经聚合酶链式反应(PCR)及测序鉴定后转染SK-BR-3细胞, 并检测HER2/neu mRNA和蛋白抑制情况及SK-BR-3细胞迁移能力的变化. 实验结果表明： 构建了3个HER2/neu shRNA真核表达质粒; 3个重组质粒均可不同程度下调HER2/neu mRNA和蛋白表达水平, 并抑制SK BR 3细胞的迁移; 其中1号重组质粒效应最强, 对mRNA和蛋白的抑制率分别为84.65%和7498%.     

分泌型Survivin真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建含6个组氨酸标签(His6)的小鼠存活素(Survivin)融合蛋白的真核表达载体,及其在真核细胞中的表达。方法:根据小鼠Survivin序列设计引物,经过RT-PCR克隆Survivin的cDNA并进一步构建分泌型Sur-vivin的真核表达载体,经测序鉴定后在大肠杆菌中扩增在HeLa细胞中表达;以金属离子螯合层析富集,再用免疫印迹法鉴定。结果:克隆到Survivin编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同。构建氨基端融合小鼠IL-2信号肽,羧基端带有His6标签的Survivin融合蛋白的真核表达载体,在HeLa细胞中转染成功并且表达;细胞上清经HisTrap HP柱层析富集后,进行免疫印迹分析,表明该融合蛋白以分泌型方式在HeLa细胞中表达。结论:成功克隆Survivin的cDNA,并构建其分泌型真核表达载体。     

Survivin基因沉默对鼻咽癌CNE-2细胞株恶性表型的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默Survivin基因对鼻咽癌细胞CNE-2恶性表型的影响.方法:设计、合成针对Survivin基因的干扰序列,并将干扰序列构建至pGCsi/U6/GFP载体,稳定转染CNE-2细胞;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot鉴定干扰效果;经四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞术、平板克隆形成实验分析沉默Survivin基因后,CNE-2细胞生长速度、细胞周期及恶性表型的改变.结果:沉默Survivin基因后,CNE-2细胞Survivin mRNA、蛋白质表达水平均明显下调;细胞生长速度下降,G1期细胞增多,S期细胞减少,克隆形成能力明显减弱.结论:Survivin基因在CNE-2细胞生长、细胞周期及恶性表型等方面都起着重要的作用.     

大鼠CRMP1基因siRNA的筛选

目的:筛选有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列.方法:化学合成3对针对大鼠CRMP1基因的特异性siRNA,用脂质转染胺(lipofectamine)LTX转染大鼠海马神经元,通过流式细胞仪检测转染效率,使用RT-PCR与实时 PCR检测CRMP1基因mRNA的表达,从而筛选抑制效率最高的siRNA.结果:流式细胞仪检测转染效率为52.5%.通过RT-PCR的初步检测和实时 PCR的定量检测结果显示,与对照组相比,所设计的3对siRNA均能不同程度抑制CRMP1基因mRNA的表达,其中CRMP1-249 siRNA抑制效果最佳,抑制率达84.3%.结论:成功筛选出1对能有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列.     

RNA干扰沉默PID1基因在C2C12细胞中表达的研究

 构建和筛选对PID1（phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1）基因有RNA干扰作用的PID1-shRNA表达载体。据小鼠PID1 cDNA序列,优化设计了4条shRNA及1条阴性干扰序列,插入pGPU6/GFP/Neo载体中,得到pGPU6/GFP/Neo-PID1-1、pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3、pGPU6/GFP/Neo PID1 4和pGPU6/GFP/Neo-PID1-NC。干扰载体转染C2C12细胞,以RT-PCR和Western blot技术检测shRNA对C2C12细胞中PID1 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明：靶向PID1基因的4个shRNA重组质粒载体经测序分析,其shRNA编码序列与预期设计的完全一致,经酶切鉴定和测序分析证实,靶向PID1基因的shRNA重组质粒载体构建成功。进一步将构建的4个表达载体分别转染C2C12细胞,24h后细胞中PID1基因mRNA表达水平依次下调 (23.58±1.87)%、(75.44±0.77)%、(70.52±0.41)% 和 (56.60±3.13)%。48 h后细胞中PID1蛋白表达水平依次降低 (30.15±5.05)%、(71.86±4.85)%、(67.93±2.28)% 和 (56.81±2.01)%。所筛选出的pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3和pGPU6/GFP/Neo-PID1-4三个表达载体均能高效地抑制转染细胞PID1 mRNA和蛋白的表达,为进一步研究PID1基因的功能奠定了基础。     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

可溶性EGF受体胞外域在HeLa细胞中的表达及鉴定

目的:在哺乳动物细胞中表达可溶性人表皮生长因子受体(sEGFR)并进行鉴定。方法:以带信号肽的sEGFR的真核表达载体pEGFR s或pEGFP-N1空载体转染HeLa细胞,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析外源基因的表达水平,并以免疫印迹法分析培养上清中的sEG-FR。结果:转染pEGFP-N1的HeLa细胞,48 h后EGFP的表达百分率可达83%,而转染pEGFR s载体的HeLa细胞EGFP阳性率为4.8%,表明由于插入的sEGFR基因包含终止密码而抑制了EG-FP的表达;共聚焦显微镜观察也得到一致的结果。进一步以抗EGFR结构域L2的抗血清进行免疫印迹分析证明,转染pEGFR s的HeLa细胞培养上清液中表达sEGFR,存在相对分子质量为83 000和80 000两种产物。结论:转染表达载体的HeLa细胞分泌表达sEGFR。     

凝溶胶蛋白表达稳定下调的小鼠肝癌高淋巴道转移力Hca-F细胞株的构建

在前期蛋白质组学和基因组学研究发现凝溶胶蛋白(Gelsolin,GSN)是一个潜在促进小鼠肝癌淋巴道转移基因基础上,本次实验设计合成3条GSN 的shRNA短发夹序列 (shRNA1、2、3),并成功将它们构建入pSilencer3.1质粒,重组质粒转染鼠肝癌高淋巴道转移力Hca-F细胞,获得了稳定转染的pSilencer-GSN-Hca-F细胞株.结果表明:GSN空白对照组和无关序列对照组细胞中在mRNA及蛋白表达水平均相近;与空白对照组相比较,3个重组质粒在mRNA水平对GSN抑制率分别为46.8%、48.2%、20.2%,在蛋白水平对GSN的抑制率分别为73.9%、45.1%、31.2%;shRNA1重组质粒的抑制效果最明显,统计学意义显著(P<0.01).通过RNA干扰和基因转染技术成功建立了GSN表达稳定下调的鼠肝癌Hca-F细胞株,为进一步研究GSN在恶性肿瘤淋巴道转移中的作用奠定了基础.     

siRNA干扰Survivin基因对结肠癌生物学特性影响

向结肠癌SW480细胞中导入针对Survivin基因的siRNA,研究RNA干扰对SW480细胞增殖和凋亡的影响,为结肠癌的基因治疗提供实验依据,同时寻求新的、有效的RNA干扰片段.设计3条特异性干扰靶向Survivin基因的siRNA,转染24,48,72h后,Western蛋白印迹法检测Survivin蛋白变化,同时噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖.3条siRNA分别作用于SW480细胞,转染24,48,72h后,3组Survivin蛋白表达均出现下调(P<0.05),在48h时达到顶峰,抑制率分别为66.5%±2.1%,49.6%±2.8%和47.8%±3.1%,差异具有统计学意义(P<0.05);MTT法显示Survivin基因沉默后,细胞增殖受到明显抑制.脂质体所介导的体外Survivin siRNA,能有效地沉默结肠癌细胞的Survivin基因,从而抑制结肠癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡,特别是针对保守区域设计的靶向siRNA.干扰效果更为显著.     

干涉UBXN1慢病毒颗粒制备及稳定细胞系的建立

构建并鉴定UBXN1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统建立稳定干涉细胞系并进一步研究UBXN1的功能。将携带不同特异性干涉序列的DNA片段插入PLKO.1载体中构建慢病毒表达载体,并制备慢病毒颗粒。将慢病毒颗粒感染U2OS细胞,建立稳定干涉细胞系,应用real-time PCR和western blot技术分别检测U2OS细胞中UBXN1 mRNA和蛋白质水平的表达差异。重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,western blot检测证实设计的五条shRNA干扰序列有效的敲低U2OS细胞中内源性UBXN1的表达。成功制备UBXN1的慢病毒干涉颗粒,并建立UBXN1稳定下调的U2OS细胞系。     

特异性siRNA对大鼠肝星状细胞TIMP-1表达的影响

观察金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）小干扰RNA真核表达载体转染肝星状细胞株HSC-T6后TIMP-1基因表达的情况。构建携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的小干扰RNA真核表达载体pGCsi-U6／TIMP-1 shRNA,利用该载体介导四个特异性和一个非特异性的TIMP-1 shRNA,分别为TIMP-1 shRNA1、TIMP-1 shRNA2、TIMP-1 shRNA3、TIMP-1 shRNA4和TIMP-1 shRNA—NON。采用阳离子脂质体介导法转染HSC-T6细胞,激光共聚焦显微镜观察GFP表达,荧光实时定量PCR方法检测TIMP-1 mRNA表达情况。质粒转染HSC—T6细胞后,激光共聚焦显微镜观察转染组细胞内均见绿色荧光,未转染组未见绿色荧光;mRNA水平检测显示：与正常对照组相比,TIMP-1 shRNA1、TIMP—1 shRNA2和TIMP-1 shRNA4对TIMP-1基因表达较强的抑制作用,尤TIMP-1 shRNA1抑制作用最强（P〈0．01）。pGCsi—U6介导的TIMP-1 shRNA1能更加有效的抑制肝星状细胞中TIMP—1的表达。     

Bc1-2 基因加强表达对 OA 诱发的细胞编程死亡的效应

ＯＡ能诱发人神经母细胞瘤ＳＫ细胞进行编程死亡．死亡细胞缩小变圆，细胞质凝聚，ＤＮＡ有控降解成约２００ｂｐ左右的片段，且这一过程可由蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮（ＣＨＸ）抑制．将编码Ｂｃ１－２全长蛋白质的ｃＤＮＡ植入ｐＸＪ４１ｎｅｏ载体中，使其表达由ＨＣＭＶ病毒启动子控制．形成的顺义（ｐＢｃｌ－２－Ｓ）及反义（ｐＢｃｌ－２－ＡＳ）表达质粒经转染导入ＳＫ细胞中获得稳定转染子，Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ印迹表明顺义转染子表达较大量的２６ｋｄＢｃ１－２蛋白，而反义转染子则不表达．增强表达的Ｂｃ１－２基因产物对ＯＡ引ＳＫ细胞编程死亡无抑制效应．     

FTH1在布鲁氏菌侵染宿主细胞中的作用

为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR筛选干扰效果最优的质粒;布鲁氏菌侵染干扰前、后的RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR检测布鲁氏菌基因16S rRNA和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量。结果显示:获得了4条特异性siRNA分子,经测序正确,pSIREN-C siRNA质粒对FTH1干扰效果最高可达98%。干扰后布鲁氏菌侵染抑制率为84%,凋亡相关基因的mRNA表达量5个降低,3个上升。本研究表明:FTH1基因沉默后布鲁氏菌胞内的生存能力下降;布鲁氏菌侵染可以抑制细胞凋亡发生,FTH1基因沉默后细胞凋亡升高。     

积雪草苷调控miR-342-5p/AQP3轴保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤

目的 探讨积雪草昔(Ass)对白细胞介素1B(IL-1B)诱导的软骨细胞损伤的影响及作用机制。方法 不同 浓度的Ass作用IL-1B诱导软骨细胞24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中白细 胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-342-5p和水通道蛋白3 (AQP3)mRNA表达水平,Western Blot法检测B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)和AQP3蛋 白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-342-5p与AQP3靶向关系。转染miR-342-5p抑制剂或AQP3过表达载体至软骨细胞,上述相同方法检测抑制miR-342-5p表达或AQP3过表达对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及IL- 6和TNF-α表达的影响。结果 Ass可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达及miR- 342-5p表达(P <0. 05),促进Bcl-2蛋白、AQP3 mRNA和蛋白表达(P <0.05)。miR-342-5p在软骨细胞中负调控 AQP3表达。抑制miR-342-5p或AQP3过表达后,IL-1&诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达降低 (P <0. 05) ,Bcl-2蛋白表达升高(P <0.05)。抑制AQP3表达逆转了抑制miR-342-5p对IL-1β诱导的软骨细胞凋 亡、Bax和Bcl-2蛋白及IL-6和TNF-α表达的影响。结论 Ass可抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡和炎症反应,其可 能通过调控miR-342-5p/AQP3保护软骨细胞损伤。     

3-MA 对阿霉素诱导 K562、K562 / ADM 细胞凋亡及其相关基因 mRNA 表达的影响

目的：通过自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对阿霉素（ADM）诱导白血病K562细胞及K562／ADM细胞的细胞效应和自噬基因Beclinl、凋亡抑制基因SurvivinmR．NA表达的变化观察,探讨自噬在细胞凋亡中的作用和机制．方法：体外培养K562和K562／ADM细胞,采用MTT法分别检测ADM及3-MA预处理对K562、K562／ADM细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时RT—PCR法检测细胞自噬及凋亡相关基因（Beclinl、Survivin）mRNA表达的变化．结果：ADM可抑制K562与K562／ADM细胞增殖,且抑制作用呈现浓度与时间依赖性．ADM诱导组K562与K562／ADM细胞在24h、48h、72h细胞凋亡率均较空白对照组明显提高（P〈0．05）．在ADM诱导前,经3-MA预处理可使ADM诱导的K562与K562／ADM细胞抑制率和细胞凋亡率均较单用ADM显著提高（尸〈0．05）,Bedin1、SurvivinmRNA相对表达量均较单用ADM明显下降（P〈0．05）,呈正相关（r=0．827,P〈0．01）．结论：ADM可抑制K562、K562／ADM细胞的生长,并诱导细胞凋亡．3-MA通过抑制细胞的自噬可增强ADM诱导白血病细胞K562、K562／ADM的凋亡,其机制可能与下调BeclinlmRNA表达,而使Survivin表达受抑制有关．     

cdk2反义RNA对乳腺癌细胞增殖及致瘤性的抑制作用

为了研究cdk2对乳腺癌细胞生长及cyclinA,cyclinB1和ckdl（cdc2)mRNA表达水平的影响,利用直接表达载体p XJ41-neo构建了表达cdk2反义RNA的重组载体,并用此载体转染了人乳腺癌细胞系Bcap37,获得了ckd2受到抑制的细胞模型Bcap37-CDK2AS,然后将Bcap37-CDK2AS细胞的生长能力及cyclinA,cyclinB1和cdk1 mRNA折水平与转入空载体的对照细胞进行了对比分析,结果显示,cdk2表达受到抑制时,细胞生长速率下降,根据测定出的细胞生长曲线,细胞培养至第7天时,细胞生长抑制率为64％,在流式细胞术的分析结果中,G1期细胞中的百分比从39％增加到47％,S期细胞由51％下降到39％,裸鼠接种的实验表明,Bcap37－CDK2AS的致瘤性明显减弱,在对cyclinA,cyclinB1和cdk1mRNA折分析中发现,Bcap37－CDK2AS中这3种基因的mRAN水平均有不同程度的下降,依据这些结果可以推测,ckd2反义RNA可使乳腺癌细胞生长及致瘤性受到抑制,并且cdk2表达的抑制将cyclinA,cyclinB和cdk14的表达水平。     

HCV感染通过Erk信号的激活上调PTTG1的表达

 为探讨丙型肝炎病毒(HCV)感染导致肝细胞癌发生的分子机制,利用前期研究建立的体外HCV细胞培养体系,将HCV JFH-1 RNA转染CD81-Huh7细胞,确定能够获得感染性HCV后,收集HCV转染后10,50,100和150d的细胞,采用Real time PCR及Western Blot法检测不同时间点细胞内垂体瘤转化基因1(PTTG1)基因和蛋白水平的表达情况,同时检测总MAPK/Erk1/2,磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)蛋白的表达。随后,用干扰素抑制HCV的感染,再检测PTTG1及MAPK/Erk1/2的表达情况,以及用MAPK/Erk抑制剂(PD98059)阻断MAPK/Erk 1/2的磷酸化后,检测PTTG1的表达情况。结果显示,HCV转染的细胞与未转染细胞比较,PTTG1的mRNA和蛋白表达均显著增加,p-Erk1/2蛋白显著升高(P＜0.05);抑制HCV感染显著降低PTTG1的表达和MAPK/Erk1/2的磷酸化(P＜0.05);MAPK/Erk1/2抑制剂显著降低了PTTG1基因和蛋白的表达(P＜0.05)。体外HCV感染可以导致MAPK/Erk信号通路的磷酸化,进一步导致原癌基因PTTG1的表达增加,这可能是慢性HCV感染导致HCV相关性肝细胞癌发生的分子机制之一。     

基于基因表达谱芯片杂交分析Lamprey-PHB2转染前后Chang liver细胞的基因表达差异

选取了10个物种与本课题组前期克隆得到的东北七鳃鳗抗增殖蛋白2(Lm-PHB2)进行氨基酸序列相似性对比,检测PHB2基因进化水平,结果表明各物种的PHB2氨基酸序列在PHB结构域处高度保守,但在N-端和C-端氨基酸序列保守性较低.将重组质粒pEGFP-N1-Lm-PHB2瞬时转染入张氏肝(CHL)细胞后,利用基因表达谱芯片技术分析基因的表达差异.结果显示CHL细胞中共有270条显著差异表达基因,其中显著上调基因共141条,显著下调基因共129条,涉及细胞信号转导、细胞周期调节、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等多个方面.通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)对基因表达谱芯片分析结果进行验证,结果显示转染pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒后,细胞周期基因CDC25C、氧化应激相关基因(CAT,SOD,GST)和抗细胞凋亡基因HAX1均有显著性差异.     

鸡survivin重组腺病毒载体的构建和体外表达

根据GenBank中鸡survivin cDNA序列,设计引物,从鸡胚组织提取总RNA,利用RT-PCR扩增鸡survivin全长cDNA,经T-A克隆后插入腺病毒穿梭载体、骨架载体,构建腺病毒重组质粒,转染293E4pIX细胞,构建鸡survivin重组腺病毒.T-A克隆的测序结果与GenBank中鸡survivin cDNA完全一致.限制性内切酶分析和PCR表明腺病毒质粒携带survivin基因,Western blot证实重组腺病毒正确表达survivin,survivin基因已被成功重组到腺病毒基因组.