丹参锚蛋白重复序列家族基因的克隆和表达分析

用降落PCR的方法获得了丹参锚蛋白重复序列家族基因(SmARP).生物信息学显示,SmARP所编码蛋白的分子质量为19,064kD,理论等电点为8.4,是一种不稳定而且无信号肽和无跨膜区域的蛋白.该蛋白的二级结构中主要存在α螺旋(39.64%)和无规卷曲(42.01%),其三维结构模型中每个锚蛋白重复序列折叠成两个反向平行的α-螺旋,每两个α-螺旋中间形成一个长环.实时荧光定量PCR结果显示,该基因在丹参的根、茎、叶、花中均有表达.     

甘蓝型油菜BnBRI1基因的克隆及表达分析

以拟南芥油菜素内酯受体BRI1基因序列设计同源简并引物,利用同源克隆技术,克隆了甘蓝型油菜中编码油菜素内酯受体基因全长cDNA序列,命名为BnBRI1(GenBank:JX871217),该基因开放阅读框(ORF)大小为3591bp,与拟南芥中BRI1基因(GenBank:NM_120100)相似性为94.21%,编码1196个氨基酸,与拟南芥中BRI编码的氨基酸相似性为89.23%.采用实时定量PCR分析表明,BnBRI1基因在根、茎、叶中都有表达,但表达量存在显著差异.在两叶一心期和花期的根中表达量最高,四叶一心期和抽薹期的叶中表达量最高.     

阳春砂磷酸甲羟戊酸激酶的基因克隆与表达谱分析

目的:为了了解阳春砂磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的功能与表达特性,根据阳春砂的转录组注释设计引物,PCR克隆阳春砂甲羟戊酸途径中的关键酶磷酸甲羟戊酸激酶基因的编码区c DNA,使用生物信息学方法对其编码的蛋白进行相似性检索及同源序列比对,构建进化树,预测二级及三级结构并分析其功能,探索其各器官中的表达差异.结果:获得了全长1 539 bp的编码阳春砂PMK的c DNA序列,命名为Av PMK(Gen Bank登录号:KF569902),编码由512个氨基酸组成的磷酸甲羟戊酸激酶,该蛋白含有GHMP激酶超家族特异的N-保守区域、C-保守区域和ATP结合位点Gly-X-Gly-XX-Ala.Av PMK与其他植物的PMK氨基酸相似性达61%~69%,进化树结果显示其与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)等单子叶植物具有较近的亲缘关系.Av PMK蛋白包含14个α-螺旋(Alpha helix),占37.1%;16个β链(Beta strand),占15.6%;32个无规则卷曲结构,占47.3%,无跨膜结构域,其3级结构含有一个催化反应的口袋状结构域.实时荧光定量PCR结果显示Av PMK基因在叶中表达量较高,茎、根中表达量相对较低.结论:首次从阳春砂仁中扩增磷酸甲羟戊酸激酶的基因片段,为分析其基因表达特性及其在砂仁萜类生物合成中的功能奠定基础.     

佛手GRAS基因的克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从芸香科柑橘属不耐寒植物佛手中分离得到了一个表达序列标签(EST)片段,结合RACE技术克隆获得该基因的1 669 bp序列,编码区长1 236 bp,编码413个氨基酸.通过Blastn同源序列比对分析,结果显示该基因与拟南芥已知的GRAS基因同源性较高;与GenBank数据库比对分析,表明该基因具有GRAS特有的保守结构域.因此,命名该基因为:CmsGRAS(GenBank登录号:JF440647).用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法研究了该基因在低温胁迫处理下的表达特性,结果显示该基因在低温胁迫后的表达量有明显的变化.     

丹参WRKY家族成员TRANSPARENT TESTA GLABRA2(TTG2)基因克隆与生物信息学分析

从丹参转录组数据库中克隆得到丹参WRKY家族成员TRANSPARENT TESTA GLABRA2(TTG2)基因(命名为SmTTG2(Genbank注册号:KC161227)),该基因包含一个长为1 425bp的完整开放读码框,编码475个氨基酸,DNA水平上包含3个内含子。序列分析显示,SmTTG2编码蛋白具有2个WRKY结构域和C2H2结构,属于I类WRKY家族成员,并且与黄瓜、怪柳等物种WRKY44高度相似。软件预测SmTTG2相对分子量为51.28kDa,等电点为8.58,且其在胞内不稳定,不具跨膜结构。利用DNA步移技术克隆获得SmTTG2基因5′侧翼区序列,分析结果显示该区域除了含有TATA box和CAAT box外,还包含应答环境因子和植物激素的、调节植物发育的顺式作用元件以及MYB转录因子结合位点。实时荧光定量PCR结果表明,SmTTG2基因在丹参花中表达量最高,且随着花期显示出逐步增高的趋势;另外SmTTG2基因的表达伴随丹参种子萌发过程,提示SmTTG2基因可能参与种子的发育和萌发过程。     

甘蓝型油菜Tic21基因克隆、表达及拷贝数鉴定

根据拟南芥Tic21基因编码区设计引物,在甘蓝型油菜中扩增并克隆到其cDNA同源基因,命名为BnTic21(GenBank登录号HQ613273),测序结果显示该基因含有5个外显子,4个内含子,cDNA编码区大小为885 bp,编码294个氨基酸,蛋白理论分子量约为31.24kD,等电点11.10.与拟南芥、豌豆等物种氨基酸序列相似性在60.40%～87.75%之间.实时定量PCR对其不同组织特异性表达分析表明:BnTic21在油菜不同部位均有表达,茎尖最高,子叶、真叶、下胚轴次之,根表达量最低.用实时定量PCR检测表明BnTic21在甘蓝型油菜基因组中约有2个拷贝.     

金发草GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及功能分析

通过RACE-PCR技术克隆得到金发草GMP基因的cDNA全长序列,命名为PpGMPase(GenBank序列号:KF586841).该基因开放阅读框长度为1086bp,编码361个氨基酸,分子式为C1787H2874N474O509S17;DNA序列由4个外显子和3个内含子组成;该基因与玉米、水稻、猕猴桃、烟草、拟南芥、番木薯等植物GMP基因具有较高的同源性,与二穗短柄草亲缘关系最近.采用荧光定量PCR方法对该基因响应非生物胁迫(盐、干旱和冷胁迫)的表达模式进行分析,结果表明:在高盐、干旱及低温胁迫后GMP基因的表达量都有显著性增加,并且其催化产物抗坏血酸含量也随之增加.     

拟南芥器官大小调控基因AtKIX8启动子的克隆和表达分析

为研究拟南芥器官大小调控基因AtKIX8的表达模式,以期进一步研究其功能机制,克隆了该基因启动子序列,获取了启动子-GUS转基因报告植株.利用GUS组织化学染色检测了该启动子作用位置,利用荧光定量PCR分析了启动子对外源激素及冷胁迫的响应.结果表明该启动子诱导GUS基因在幼苗茎尖分生区,成株茎、叶主脉中特异性表达,生长素和低温处理显著提高GUS基因的表达量.说明拟南芥AtKIX8基因启动子具备组织特异性表达模式,且能受到外源生长素和低温的诱导.     

枸杞抗坏血酸氧化酶基因的克隆与表达分析

以枸杞为材料,利用同源克隆技术,克隆了枸杞抗坏血酸氧化酶(AO)的全长cDNA序列,命名为LcAO基因(GenBank:KP712033),该基因开放阅读框(ORF)大小为1737bp,编码578个氨基酸,与西红柿AO蛋白的同源性达到90%.LcAO编码的氨基酸序列包含3个多铜氧化酶结构域和跨膜信号序列.采用实时荧光定量PCR分析显示,LcAO基因在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少.     

甘蓝型油菜BnDHAR基因的克隆及表达分析

在甘蓝型油菜矮化突变体与其高秆亲本构建的消减杂交文库中,得到一长约230bp与编码脱氢抗坏血酸还原酶的DHAR基因核苷酸序列相似的DNA片段.采用同源克隆技术,在甘蓝型油菜中获得该基因的全长cDNA序列,命名为BnDHAR.BnDHAR与已公布的甘蓝型油菜基因组中的该基因核苷酸序列完全一致.对BnDHAR基因不同发育时期组织的表达分析的结果显示,BnDHAR基因在高秆油菜苗期的叶中表达量最高,是矮化突变体的5倍,在根、茎中表达极低,具有组织特异性.非生物胁迫显著影响BnDHAR表达,高温胁迫使其表达升高,盐胁迫处理9h时达最高,而干旱胁迫时表达量在处理12h时才达最高.     

血吸虫膜相关抗原基因的克隆

目的:筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S.japonicum)新的疫苗候选抗原基因.方法:以S.japonicum成虫DNA为模板,PCR扩增相关基因,然后将其克隆XpBS-T载体,通过菌落PCR对产物进行检测,对阳性克隆子测序,与GeneBank中的已知相关序列进行比对分析.结果:菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明PCR产物与S.japonicum 22.6 kDa抗原分子核苷酸序列具有高度同源性.其目的基因大小636 bp,具有一个189 bp的ORF,能编码63个氨基酸.ORF不是全长的阅读框,只获得部分编码区.表达产物可含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).讨论:成功克隆出一个与S.japonicum 22.6kDa抗原编码基因有高度同源性的基因.预测该基因为膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体表膜相关蛋白.在生理机能上,该膜相关蛋白可能是信号传递分子.     

白骨壤重金属耐受性相关基因AmNramp3的克隆与分析

白骨壤(Avicennia marina(Forsk.)Vierh.)作为红树林的先锋植物,广泛分布于我国南海沿岸,是一种研究红树植物重金属污染物耐受性分子机制很好的材料.以抑制消减杂交获得的白骨壤重金属耐受性相关基因AmNramp3片段为基础,设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了其全长,长度为1 958bp;通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了AmNramp3在重金属镉胁迫时白骨壤叶、茎和根中的表达情况,其表达量在叶中高于根和茎中,但在茎和根中有快速的响应.利用生物信息学方法预测并分析了该基因的开放阅读框,位置位于1~1 527bp,编码508个氨基酸;进而预测并分析了AmNramp3蛋白的结构,发现其氨基酸序列中不含有信号肽,说明其不是分泌蛋白;但其具有很复杂的跨膜结构,是一种跨膜蛋白.综上,AmNramp3基因编码一种跨膜蛋白,在重金属镉胁迫下表达量快速变化,可能与镉的跨膜运输密切相关,这为后续分析该基因发挥功能的分子机制奠定了基础.     

大熊猫肠道菌抗生素抗性菌转座酶的基因克隆和表达

对大熊猫肠道大肠杆菌抗生素抗性质粒pAm08CD7339全序列的生物信息学分析结果表明,该质粒中存在一个编码转座酶的DNA片段,两条DNA链均可编码转座酶,其编码区长度分别为717 bp和600 bp,编码238个和199个氨基酸残基（分别命名为Transposase238和Transposase199）.以pAm08CD7339质粒DNA为模板,利用PCR方法对2个转座酶基因进行扩增,构建相应表达质粒,转化不同大肠杆菌菌株进行表达,结果表明：Transposase199可以在E.coli BL2     

南高丛蓝莓VcMET1基因分离及在果实发育中的表达分析

为研究DNA甲基化相关基因在南高丛蓝莓(Vaccinium corymbosum)果实发育过程中的表达模式,以蓝莓大果品种‘奥尼尔’(O'Neal)与小果品种‘蓝雨’(Bluerain)为试材,分离DNA甲基化相关基因Vc MET1编码区c DNA,并对其在果实发育进程中的表达水平进行实时荧光定量PCR(q PCR)检测.结果表明:分离得到的Vc MET1蛋白质序列均包含在植物中高度保守的Dcm,MTase与BAH结构域,表明DNA甲基化基因MET1在进化上相对保守; q PCR分析发现蓝莓Vc MET1在果实发育早中期表达丰度较高,后期表达迅速下降,甚至无法检测,推测该基因可能参与调控蓝莓果实的生长发育.     

水稻泛素缀合酶基因OsUbc13的分子特征和蛋白互作研究

研究目的：通过研究水稻泛素缀合酶基因OsUbc13的序列特征、表达模式、亚细胞定位模式及其互作分子,为深入研究该基因的生物学功能和分子作用机理奠定基础。创新要点：首次对植物Ubc13进行了亚细胞定位研究及蛋白互作研究。研究方法：通过序列比对及聚类分析进行OsUbc13的序列特征研究;通过实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）进行OsUbc13的表达模式分析;通过聚乙二醇（PEG）介导转化烟草BY-2原生质体进行OsUbc13亚细胞定位研究（见图4）;通过酵母双杂交进行OsUbc13的蛋白质互作分析（见图5和表1）。重要结论：OsUbc13编码具有153个氨基酸的蛋白质,其推断的氨基酸序列与其它同源序列具有很高的相似性;该基因在水稻各组织中均有表达,其中内稃、雌蕊、雄蕊和叶片中的表达量较高,而根、茎和外稃中的表达量较低;低温、甲基磺酸甲酯（MMS）和过氧化氢（H2O2）胁迫处理使胚性愈伤中OsUbc13的表达量显著上调,甘露醇、脱落酸（ABA）和氯化钠（NaCl）胁迫则使愈伤组织中该基因的表达量降低;OsUbc13与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白表达于质膜和核膜处;酵母双杂交结果表明约有20个蛋白可能与OsUbc13存在相互作用,其中OsVDAC（与细胞凋亡有关）、OsMADS1（与花器官发育有关）、OsB22EL8（与活性氧清除及DNA 保护有关）和OsCROC-1（为Lys63聚合泛素链形成及运行无误性DNA 损伤耐受机制所必需）四个蛋白经验证确与OsUbc13互作。     

家蚕浓核病毒BmDNV-1(伊那株)结构蛋白基因VP4的克隆、表达及抗体制备

为研发新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)疫苗候选抗原基因,为血吸虫诊断和疫苗研制提供依据,提取和纯化S.japonicum成虫DNA,PCR扩增相关基因,然后将其克隆入pBST载体,对菌落PCR阳性克隆子测序和分析.菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,PCR产物与S.japonicum 22 600抗原分子DNA序列具有高度同源性,636 bp大小,oRF189 bp,ORF小是全长的蒯读框,只获得部分编码区,能编码63个氨基酸,表达产物含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).本研究所获取的阳性克隆是与S.japonicum 22 600抗原编码基因有高度同源性的基因.通过Blastn和BLASTP分析,预测该基因为体膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体壁相关蛋白,可能是信号传递分子.     

拟南芥CBF基因的克隆

CBFs是拟南芥中能与低温响应元件CCGAC结合的转录因子，通过诱导冷调节基因(COR)的表达从而增强植物的耐冻性。CBFs由一个小的基因家族编码，包括3个成员：CBF1、CBF2和CBF3，在序列上高度相似。我们根据其编码基因的启动子和终止子中的一致序列，设计了一对PCR引物，用一次反应即同时获得了这3个基因的克隆。     

一个麻风树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因的克隆和鉴定

通过PCR技术克隆得到一个麻疯树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因(JcKTI)的开放阅读框序列(540bp),对应的基因组序列不含内含子.该序列编码一个含有179个氨基酸残基的成熟多肽,其在根和茎中的表达最高,在叶片和种子中较低.原核表达的重组蛋白显示出一定的抑制牛胰蛋白酶的活性,过表达该基因的转基因烟草蛋白提取物对胰蛋白酶具有一定抑制作用,同时转基因烟草叶片可使进食后的棉铃虫幼虫生长发育受阻,摄食量减少.上述结果暗示JcKTI基因可能在麻疯树根和茎的抗虫应答中扮演着一定的角色.     

地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

新疆无苞芥OpNAC083基因的克隆与表达分析

本研究通过对新疆耐逆植物无苞芥幼苗c DNA文库的随机克隆测序分析,获得1条与拟南芥NAC转录因子基因At NAC083高度相似的EST序列(Gen Bank登录号为JZ151841),该序列包含1个723 bp最大开放阅读框(ORF),推测编码240个氨基酸。根据该ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术从无苞芥叶片的c DNA中克隆了该基因,命名为Op NAC083。比对分析结果表明在其N端具有一段No apical meristem(NAM)保守结构域;该蛋白的二级结构包含33个α-螺旋和11个β-转角。系统进化树分析结果表明,Op NAC083编码产物与拟南芥At NAC083和琴叶拟南芥ANAC083进化关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析基因表达结果显示,Op NAC083在无苞芥的不同组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫处理2 h、ABA处理6 h明显诱导该基因的表达,但PEG-6000和4℃胁迫却抑制该基因的表达。这表明Op NAC083在无苞芥应对盐和ABA胁迫中可能起着重要作用。