P38α对人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响

目的:研究P38α对人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响.方法:利用硝酸还原酶法检测不同浓度氯化钴作用下人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)上清中的一氧化氮(NO)的含量.以pRL-TK为内参照,将已经构建好的pGL2-eNOS-p质粒分别与pGL3-BASIC、pcDNA3、p38a、及p38a(AF)共转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测eNOS基因启动子转录活性,并在共转染的基础上加氯化钴刺激,并检测eNOS基因启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的NO含量随氯化钴作用浓度增加而提高,成功建立化学缺氧模型;p38a在正常和缺氧条件下均明显降低eNOS基因启动子的活性,可被无活性诱变体p38a(AF)逆转.结论:P38et下调人血eNOS基因启动子转录活性.     

氯化钴对人eNOS基因启动子转录活性的影响

目的:建立氯化钴诱导的人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)缺氧模型,研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因的启动子活性变化.方法:用含不同浓度氯化钴的培养基培养细胞,检测细胞培养上清中的乳酸脱氢酶(LDH)含量;将已构建的pGL2-eNOS-p质粒转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测在不同浓度氯化钴和不同作用时间下的eNOS启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的LDH含量随氯化钴作用浓度增加而提高;氯化钴刺激后转染细胞的eNOS启动子活性呈现随氯化钴剂量增加而升高的趋势,随作用时间的延长而上升的趋势.结论:成功建立氯化钴诱导HUVEC-12细胞缺氧的体外模型.     

siRNA干扰p38α上调人血管eNOS基因启动子转录活性

目的:通过靶向 p38α的siRNA干扰人血管内皮细胞的 p38α信号通路,探索其对血管内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的调节作用.方法:利用 Western 印迹检测 siRNA-p38α干扰HUVEC-12细胞后 p38α蛋白的表达,确定 siRNA-p38α的最佳作用时间和浓度,然后通过双荧光素酶报告基因技术检测转染 siRNA-p38α后细胞裂解液的荧光强度,分析eNOS基因启动子的转录活性变化.结果:与对照组比较,siRNA-p38α干扰后 p38α蛋白表达明显减弱,而相应的 eNOS启动子转录活性上调, 以100 nmol/L 的 siRNA-p38α作用 48 h 的效果最佳.结论:siRNA干扰 p38α信号可上调人血管内皮细胞 eNOS基因的转录活性.     

Pax5启动子的克隆及其在人淋巴瘤细胞系HL-60中转录因子的确定

克隆Pax5基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性;采用PCR技术从人淋巴瘤细胞系HL-60基因组中扩增出Pax5启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性;测序结果表明扩增的Pax5启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,转录因子SP1和Runx1能以剂量依赖的方式提高Pax5报告基因的转录活性;克隆了Pax5启动子,并发现转录因子SP1和Runx1能够调控Pax5的转录。     

人STK11基因启动子区域的克隆

通过生物信息学分析,预测人STK11基因可能的转录起始位点和重要的调控区域.以此为基础,构建含人STK11基因上游序列缺失片段的pGL3重组载体,瞬时转染L-02和HeLa两种细胞系,通过检测荧光素活性分析缺失片段的启动活性.结果显示各缺失片段在两株细胞中均有启动活性;当3'端固定在-918时,5'端由-1943--1425的移位对启动活性无明显影响,提示这一区间内不存在重要的顺式作用元件;将5'端固定在-1943时,随着3'端向5'的缩短(-918→-1039→-1160),启动活性明显增强(活性pGL3-1943A＞pGL3-1943B＞pGL3-1943C),提示-1160--1039和-1039--918的区间分别存在负性顺式作用元件,同时提示核心启动子的3'端位于-1160的5'末端.在pGL3-1322(-1322--918)亦观察到启动活性,提示核心启动子的5'端应该位于-1322的3'末端.因此,人STK1 1基因的核心启动子位于-1322--1160之间.     

细胞色素P450花生四烯酸表氧化酶BM3F87V上调内皮一氧化氮合酶基因的表达

血管内皮细胞富含细胞色素P450表氧化酶,它代谢花生四烯酸产生内皮源性超极化因子,(EDHF,即EETs),它与血管内皮细胞产生的一氧化氮(NO)之间的关系尚不清楚.经转基因技术在原代培养的牛主动脉内皮细胞中产生内源性EDHF,并研究了EDHF对NO合成的关键酶---内皮NO合酶(eNOS)基因表达的调节作用.将表氧化酶基因CYP BM 3 F87V克隆于真核表达载体pCB 6 ,转染了经3～4代培养的牛主动脉内皮细胞,产生高浓度的内源性14,15-EET.采用Western blot和Northern blot分别从蛋白质水平和RNA水平判断内源性14,15-EET对eNOS基因表达和转录的影响,同时根据[ 3 H] L-精氨酸转变为[ 3 H] L-瓜氨酸的水平来判断其对eNOS活性的影响.结果显示:与转染pCB 6 的对照细胞相比,转染的pCB 6 -BM 3 F87V在内皮细胞中过度表达后能显著上调eNOS的蛋白质表达和eNOS的mRNA水平,明显增加了eNOS的活性.因此,转染表氧化酶BM 3 F87V对eNOS基因有显著上调作用.这提示细胞色素P450表氧化酶能够通过促进内皮细胞内EDHF的产生来调节NO生成,进而改善内皮细胞功能,这可能为治疗心血管疾病提供了一种新思路.     

人STK11基因启动子区域的克隆

通过生物信息学分析，预测人STK11基因可能的转录起始位点和重要的调控区域.以此为基础，构建含人STK11基因上游序列缺失片段的pGL3重组载体，瞬时转染L-02和HeLa两种细胞系，通过检测荧光素活性分析缺失片段的启动活性.结果显示各缺失片段在两株细胞中均有启动活性；当3′端固定在-918时，5′端由-1943—-1425的移位对启动活性无明显影响，提示这一区间内不存在重要的顺式作用元件；将5′端固定在-1943时，随着3′端向5′的缩短（-918→-1039→-1160），启动活性明显增强（活性pGL3-1943A＞pGL31943B＞pGL3-1943C），提示-1160—-1039和-1039—-918的区间分别存在负性顺式作用元件，同时提示核心启动子的3′端位于-1160的5′末端.在pGL31322（-1322—-918）亦观察到启动活性，提示核心启动子的5′端应该位于-1322的3′末端.因此，人STK11基因的核心启动子位于-1322—-1160之间.     

耐热、高产重组人Cu,Zn-SOD改构体的构建及纯化方法的研究

目的通过对天然人Cu,Zn-SOD基因的改造,得到热稳定性、活性产量提高的重组人Cu,Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)改构体,并进行蛋白纯化方法的研究。方法重叠PCR技术将天然hCu,Zn-SOD的Cys6突变为A la6,Cys111突变为Ser111,构建重组质粒pET22b-rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDS-PAGE分析改构体蛋白的表达,并进行W estern blot鉴定;研究改构体蛋白的纯化方法,HPLC检测蛋白纯度,比较rhCu,Zn-SOD及其改构体的活性和热稳定性。结果成功构建了rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser表达载体;SDS-PAGE显示rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser蛋白在BL21(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量占菌体蛋白总量的64.6%;Western blot结果显示表达产物可以特异性地与小鼠抗人SOD多克隆抗体结合;纯化得到纯度大于95%的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Se改构体蛋白,从1g湿菌体中获得的活性蛋白总量高于未改构体的2倍;改构体的热稳定性较未改构体获得大幅提高。结论构建的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser改构体具有较好的热稳定性和较高的活性产量,摸索出一种比较简易的蛋白纯化工艺,为Cu,Zn-SOD的广泛应用奠定基础。     

GATA-3启动子报告基因载体构建及其活性鉴定

目的转录因子GATA-3在人乳腺癌的发生发展中扮演重要的角色,研究其转录调控有重要意义.方法从人乳腺癌细胞系MCF-7提取基因组DNA为模板,以PCR方法扩增获得GATA-3启动子序列,将片段克隆到pGL3-Basic载体内,鉴定后通过报告基因检测系统检测GATA-3启动子报告基因的荧光素酶活性.结果双酶切、基因测序鉴定结果显示,成功构建了GATA-3启动子报告基因,并在MCF-7细胞内鉴定了其具有荧光素酶的表达活性.结论本实验成功构建了GATA-3启动子报告基因载体pGL3-GATA-3pro-Luc,为后续GATA-3在乳腺癌中表达及其调控通路以及以GATA-3为靶标的抗肿瘤药物研究提供了有效工具.     

鱼腥草素钠对人脐静脉内皮细胞NO合成及NOS活力的影响

目的:研究鱼腥草素钠对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)NO合成及一氧化氮合酶(NOS)活力的影响.方法:采用15μg/ml LPS作用于HUVECs,共同孵育12h建立炎性损伤细胞模型.考察不同剂量鱼腥草素钠对各组HUVECs细胞存活率、培养上清液中LDH活力、NO含量、内皮型NOS(eNOS)及诱导型NOS(iNOS)表达的影响.结果:鱼腥草素钠可明显提高HUVECs细胞存活率,增加NO的分泌与释放,提高eNOS与降低iNOS活力,从而保护脂多糖诱导的HUVECs炎性损伤.结论:鱼腥草素钠对脂多糖诱导损伤的内皮细胞具有保护作用,其机制与其促进内皮细胞NO分泌与释放,增强eNOS活性和表达,改善血管内皮功能状态相关.     

MEK5α和MEK5β调控Beclin 1启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因,调控自噬起始和自噬体成熟.在肌肉分化过程中,Beclin 1基因表达上调,自噬增加;此外MEK5-ERK5信号活化并调控成肌细胞分化.因此,在肌肉分化过程中,MEK5-ERK5信号通路可能调控Beclin 1基因表达.目的是阐明MEK5对成肌细胞Beclin 1基因启动子活性的调控.将不同长度Beclin 1启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12.双荧光素酶报告基因检测实验结果显示,含Beclin 1基因起始密码子上游586碱基对DNA片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性.MEK5α显著增加p-354荧光素酶活性,并有剂量依赖性;而MEK5β显著降低p-354荧光素酶活性.MEK5β能够拮抗MEK5α对p-354荧光素酶活性的调控.与MEK5对Beclin 1基因启动子调控结果一致,MEK5αCA上调细胞Beclin 1 mRNA表达,MEK5βDD下调Beclin 1mRNA表达,并且MEK5βDD抑制MEK5αCA对Beclin 1 mRNA表达的促进作用.此外,转录因子CREB家族成员CREB3,CREBP和CREBL1能够显著上调p-354荧光素酶活性.CREB3呈剂量依赖性显著上调p-354荧光素酶活性,并与MEK5α具有协同效应.MEK5α和MEK5β对Beclin 1启动子具有不同调控作用,CREB可能是其下游效应因子.     

猪hnRNPK基因启动子的克隆及序列分析

首次克隆了猪hnRNPK基因启动子序列,并进一步对该序列进行了分析.结果显示:该基因启动子约1 kb,与已报道的人的相应序列相似度为78.9%,具有相同的"TCTCGCGAGA"核心启动子序列和转录起始位点.利用在线软件分析发现,猪hnRNPK基因启动子不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区,存在两处CpG岛,具有SP1、UCE.2、GCF、EARLY-SEQ1、TTR_inverted_repeat、NGFI-C、EARLY-SEQ1等多种转录因子潜在结合位点,并且具有8种基序结构.     

猪hnRNPK基因启动子的克隆及序列分析

首次克隆了猪hnRNPK基因启动子序列,并进一步对该序列进行了分析.结果显示:该基因启动子约1 kb,与已报道的人的相应序列相似度为78.9%,具有相同的"TCTCGCGAGA"核心启动子序列和转录起始位点.利用在线软件分析发现,猪hnRNPK基因启动子不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区,存在两处CpG岛,具有SP1、UCE.2、GCF、EARLY-SEQ1、TTR_inverted_repeat、NGFI-C、EARLY-SEQ1等多种转录因子潜在结合位点,并且具有8种基序结构.     

山羊Agouti基因启动子活性区域探究

对前期拼接获得的12 847 bp山羊Agouti基因序列(EF587236和JN651404)进行启动子活性区域预测,确定候选启动子区为6 450~7 100 bp,得到一个长度为2 537 bp的DNA片段,在该区域发现一个典型转录因子结合位点TATA框,并预测到HSF,SYR,GATA-1,Nkx-2,ADR1等多个转录因子结合位点;山羊基因组序列(登录号:AJPT01136617.1)中有两段序列与牛的预测启动子promoter A和promoter B同源性较高,据此设计引物扩增目的片段,同时构建12个荧光素酶报告基因质粒,瞬时转染人皮肤黑素瘤细胞A375和293T细胞检测目的片段是否具有Agouti基因启动子活性。结果表明,所构建的目的片段质粒与阴性对照相比无显著差异,说明所获得的目的片段不具有启动子活性。     

人MiTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

人MiTERF3基因编码线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子。采用PCR技术对人MiTERF3基因5''侧翼上游1251 bp启动子序列进行扩增,并将其克隆至荧光素酶表达载体pGL6-TA,构建人MiTERF3基因启动子荧光素酶报告基因质粒。经酶切、测序鉴定后,将其用脂质体转染体外培养的HEK293细胞株,利用双荧光素酶测定系统检测其表达活性。研究结果表明,克隆获得的1251 bp DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。含人MiTERF3基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高（P<0.05）,约为对照组（空载体pGL6-TA）的9.8倍。本研究通过对人MiTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶表达载体构建与表达活性的测定,为进一步阐明人MiTERF3基因表达的调控机制奠定实验基础。     

不同亚型人SMYD3启动子转录活性比较

利用PCR方法克隆SMYD3两个亚型的启动子区域,并构建其荧光素酶报告质粒.转染COS-7细胞后,利用荧光素酶报告分析技术,对二者启动子的转录活性进行了检测和比较.结果显示:SMYD3亚型1启动子的转录活性要显著高于亚型2启动子,生物信息学分析提示其原因可能与含有转录因子E2F-1结合位点的串联重复序列有关.     

人cidec基因启动子的克隆及 PPARγ 上调其活性大小比较研究

人诱导细胞死亡的 DFF45 样效应因子 C(Cell death-inducing DNAfragmentation factor 45-like c,cidec)可调节脂肪代谢,与动脉粥样硬化有密切联系,研究显示该因子表达受到过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(Peroxisomeproliferator-activated receptor gamma,PPARγ)的调节,但其中的表达机制还不清楚。从人肝癌细胞 HepG2 中扩增 cidec基因启动子不同长短片段,分别克隆到虫荧光素酶报告基因载体中;cidec 基因启动子片段重组报告基因质粒转染HepG2 细胞,经 PPARγ 激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,ROZ)处理后,检测荧光素酶活性。结果发现,cidec 基因启动子(-1 800～+150 bp)加 ROZ 前后均无明显变化,而 cidec 基因启动子(-2 289～+150 bp)质粒荧光素酶活性明显增加,且加 ROZ 后活性显著升高(p<0.05)。这表明激活 PPARγ 可能通过 cidec 基因启动子的-2 289～-1 800 bp 区域 PPARγ结合元件而上调该基因转录活性。
     

中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子克隆与分析

为了探明中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子表达调控机制,利用DNA步移法克隆了中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子及其上游调控序列,总长1 100bp.分析表明,在基因转录起始位点上游-30～-24bp处有1个TATA box,未发现有CAAT box和GC box.同时,在上游调控区还存在有多个可能影响启动子转录活性的顺式作用元件,如NF-κB,YY1和SP1等转录因子结合位点.这些结果为深入研究中国明对虾卵黄蛋白积累及卵子发生过程奠定了基础.     

建立一个基于报告基因的靶标筛药系统筛选上调ABCA1基因转录的中药提取物

ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)具有催化外周细胞过量胆固醇和磷脂外向流出的功能。本实验将ABCA1启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,并将得到的重组质粒pGL3B-neo/ABCA1转染入人肝癌细胞(hepG2)。通过稀释培养法最终得到含有重组质粒的稳定细胞系SABCA1。利用这个报告基因为基础的药物筛选系统,筛选了100多种中药提取物。通过荧光素酶活性测试,相对活性达到180%以上的有4种中药提取物,并最终挑选能明显激活ABCA1基因启动子的鬼箭羽水提组分进一步研究,得出半数有效浓度(EC50)为48.06 mg/L。此外,利用基于apoA1基因的药物筛选系统验证得出鬼箭羽水提组分也能促进apoA1基因的表达。     

MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 调控 ${\bf Beclin}$ 1 启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因, 调控自噬起始和自噬体成熟. 在肌肉分化过程中, Beclin 1 基因表达上调, 自噬增加; 此外 MEK5-ERK5 信号活化并调控成肌细胞分化. 因此, 在肌肉分化过程中, MEK5-ERK5 信号通路可能调控 Beclin 1 基因表达. 目的是阐明 MEK5 对成肌细胞 Beclin 1 基因启动子活性的调控. 将不同长度 Beclin 1 启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12. 双荧光素酶报告基因检测实验结果显示, 含 Beclin 1 基因起始密码子上游 586 碱基对 DNA 片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性. MEK5$\alpha $显著增加 p-354 荧光素酶活性, 并有剂量依赖性; 而 MEK5$\beta $ 显著降低 p-354 荧光素酶活性. MEK5$\beta $能够拮抗 MEK5$\alpha $对 p-354 荧光素酶活性的调控. 与 MEK5 对 Beclin 1 基因启动子调控结果一致, MEK5$\alpha $CA 上调细胞Beclin 1 mRNA 表达, MEK5$\beta $DD 下调 Beclin 1 mRNA 表达, 并且 MEK5$\beta $DD 抑制 MEK5$\alpha $CA 对 Beclin 1 mRNA 表达的促进作用. 此外, 转录因子 CREB 家族成员 CREB3, CREBP 和 CREBL1 能够显著上调 p-354 荧光素酶活性. CREB3 呈剂量依赖性显著上调 p-354 荧光素酶活性, 并与 MEK5$\alpha $ 具有协同效应. MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 对 Beclin 1 启动子具有不同调控作用, CREB 可能是其下游效应因子.