兔骨髓间充质干细胞复合脱细胞牛松质骨体外相容性研究

探讨脱细胞牛松质骨（Acellular Bovince Cancellous Bone，ABcB）生物衍生材料与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的生物相容性，为组织工程方法修复骨缺损提供依据。将兔骨髓间充质干细胞与ABCB复合并体外培养，然后进行形态学、细胞增殖、蛋白质含量测定。骨髓间充质干细胞能够贴附在ABCB孔隙内生长，细胞生长及蛋白合成功能不受ABCB的影响。ABCB生物相容性良好，可作为组织工程的支架材料应用于骨缺损的修复；BMSCs可以作为骨组织工程种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及生物性状研究

分离培养人骨髓间充质干细胞，研究其在体外生长增殖的生物特性。冲洗手术弃骨骨髓，获取骨髓间充质干细胞进行培养，倒置相差显微镜观察细胞生长情况，绘制生长曲线，免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原，进行染色体核型分析。冷冻保存细胞复苏后的生长状况观察。结果显示，原代和传代培养的细胞呈现梭形外观，具有较强的生长增殖能力；细胞CD44，CD54抗原表达阳性，CD34表达阴性。染色体核型分析表明是正常的人二倍体细胞。复苏细胞生物学特性无明显改变。     

红景天苷对BMSC生物学特性影响

目的：研究红景天苷对骨髓间充质干细胞（Bonemesenchymalstemcells,BMSCs）生物学活性影响。方法：采用贴壁法分离培养BMSCs,检测细胞表面分子表达对所获干细胞进行鉴定。以终浓度为10¨g／mL红景天苷与BMSCs共培养,通过形态学观察和MTT法分析研究其对BMSCs生物学特性影响。结果：成功培养出BMSCs,免疫荧光染色显示,培养的第3代BMSCs表达CD29、CD44干细胞标志。10μg／mL红景天苷与BMSCs共培养后,较对照组细胞生长更为旺盛,更为规整,形成典型的“鱼群状”。生长曲线显示,实验组细胞较对照组生长稳定,增殖能力活跃。结论：10μg／mL红景天苷可促进BMSCs增殖分化,又不影响细胞增殖分化等生物学特性。     

纳米相陶瓷支架与人成骨细胞生物相容性的体外实验研究

研究了2种新型多孔纳米陶瓷支架材料(hydroxyapatite,HA和tricalcium phosphate,TCP)的生物相容性.从人4月龄胚胎骨膜组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞(periosteal-derived osteoblast,POB),采用人胚骨膜成骨细胞与2种陶瓷支架的体外复合培养,观察细胞在材料上的生长及生理功能表达情况.发现人POB在HA和TCP表面生长繁殖良好,并发挥成骨功能.材料对细胞的增殖还有一定的促进作用(p<0.05).实验表明: 2种新型多孔陶瓷支架材料均有良好的生物相容性.     

腺苷酸环化酶(AC)基因家族在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达

骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是骨髓中具有多向分化潜能的干细胞,腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)作为第二信使c AMP信号通路的重要组分,在BMSCs的成骨/成脂分化中具有重要作用,但BMSCs中AC亚型表达种类,尚待明了。通过对小鼠BMSCs原代培养条件优化,获得最适培养条件下生长良好的细胞,提取其总RNA并反转录;采用RT-PCR和序列比对分析,鉴定了小鼠BMSCs中AC亚型的表达种类。研究发现:1小鼠BMSCs原代培养:以4.0×106cell/m L的骨髓单核细胞浓度培养,并于4 d首次换液,增殖速度快,可以达到后续实验要求;2原代小鼠BMSCs中AC亚型表达种类分别为AC2、AC3、AC4、AC6、AC7和AC9。     

模拟微重力抑制间充质干细胞增殖机制的研究

研究微重力对间充质干细胞增殖影响的潜在机制.用随机定位仪模拟微重力(SMG),培养小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测SMG对BMSCs增殖,细胞骨架,以及对细胞的黏附和增殖重要信号分子表达的影响.结果显示,在SMG下,BMSCs增殖受到抑制;细胞微丝结构和分布异常;细胞形态改变;黏着斑激酶(FAK)表达下降;细胞生长信号分子ERK1/2和Akt的磷酸化水平以及p85β表达下降.结果表明,模拟微重力条件下的细胞骨架改变、细胞黏附性降低和细胞增殖的信号通路相互作用,导致对骨髓间充质干细胞增殖的抑制作用.     

脱钙人牙基质复合胶原骨修复材料的制备与性能研究

本研究探讨脱钙人牙基质(Decalcification Tooth Matrices DTM)复合胶原材料作为骨修复材料的可行性.采用冻干后高温交联的方法制备脱钙人牙基质复合胶原材料;利用扫描电镜、X射线衍射、红外(IR)分析及电子能谱(EDS)分析材料表征;通过成骨细胞MCT3T-E1与材料混合培养分析材料的生物相容性及诱导骨细胞生长活性.结果显示材料分布均匀,形成多孔疏松的支架,其主要成分为羟基磷灰石晶体,材料不影响成骨细胞的分裂,且对细胞增殖有明显促进作用.研究表明脱钙人牙基质复合胶原材料具有骨修复材料的结构特点,且具有良好的细胞相容性及诱导成骨细胞增殖活性.     

改性羟基磷灰石/聚乳酸复合材料制备及其生物相容性评价

针对聚乳酸(PLLA)和羟基磷灰石(HA)两者复合时界面相容性差的问题,采用硅烷偶联剂十八烷基三氯硅烷(OTS)对HA颗粒进行了表面改性,通过热诱导相分离法制备了OTS-HA/PL-LA多孔复合材料.扫描电镜结果表明,OTS-HA/PLLA多孔复合材料中改性HA颗粒的分布较均匀,PLLA和改性HA颗粒之间的界面相容性得到了改善.孔隙率测试表明,OTS-HA/PLLA多孔复合材料的孔隙率均大于90%,适合骨修复材料对孔隙率的要求.细胞培养结果表明,复合材料对骨髓间充质干细胞的生长无抑制作用,细胞在材料表面能正常黏附、生长、增殖,具有良好的细胞附着形态和细胞增殖率,表现出了良好的生物相容性.     

过表达IL-8受体对脐带源间充质干细胞生物活性的影响

目的探究腺病毒介导的IL-8受体过表达对脐带源间充质干细胞生物活性的影响。方法本研究利用含有IL-8RA和IL-8RB的c DNA和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒载体(p Ad-IL-8RA-GFP、p Ad-IL-8RB-GFP和p Ad-Null-GFP)分别转染分离培养的P3-5代脐带源间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测干细胞标签蛋白CD29、CD44、CD34、HLA-DR的表达,CCK-8实验检测转染后细胞的增殖能力,粘附实验及Transwell趋化实验观察过表达IL-8RA/B的脐带源间充质干细胞的迁移能力。结果脐带源间充质干细胞形态均一、生长状态良好;干细胞特异性相关蛋白CD29、CD44阳性表达,CD34、HLA-DR阴性表达;与对照组比较,IL-8RA/B过表达的脐带源间充质干细胞的增殖能力无明显改变,但是过表达IL-8RA/B的间充质干细胞粘附在损伤内皮上以及迁移到小室下方的细胞数目更多。结论以上结果表明IL-8RA/B的过表达不影响脐带源间充质干细胞的增殖能力,但是能够促进脐带源间充质干细胞向IL-8趋化和向损伤内皮细胞粘附。     

磷酸钙与胶原双相多级仿生骨组织工程支架研究

磷酸钙与胶原是天然骨组织的重要组成成分,介绍了一种仿生设计磷酸钙与胶原双相复合的多级仿生骨组织支架.采用双氧水发泡技术精确定制磷酸钙支架孔结构,结合真空灌注胶原以及仿生矿化技术,构建磷酸钙,胶原双相多级仿生骨组织支架,材料的孔结构及化学组分可实现定制设计.通过对支架材料测试表征,结果显示,这种无机/有机/无机多级仿生支架材有良好的力学性能.材料的体外细胞实验结果证实,这种多级仿生支架材料具有良好的生物相容性.     

无细胞猪真皮的生物相容性评价

采用猪皮制备的无细胞真皮基质,在基质上接种血管内皮细胞(VEC),鼠成纤维细胞(3T3),在细胞水平检测其生物相容性.采用MTT法检测VEC、3T3在基质上增殖活力;将复合培养1周的VEC-真皮复合物作组织切片,光镜下观察细胞生长状况.结果发现VEC在无细胞猪真皮基质上增殖迅速,并已经形成单层细胞膜片,某些局部区域已形成2～3层细胞膜片.结果说明采用的无细胞猪真皮基质具有良好的生物相容性,该材料可能有广泛的应用前景.     

蛋白激酶D1对骨髓间充质干细胞中CXCR4的调控作用

目的:探讨蛋白激酶D1(PKD1)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)存活、增殖、迁移和凋亡的影响,并分析PKD1对趋化因子受体4(CXCR4)表达的调控作用.方法:从Wistar大鼠股骨和胫骨中分离并收集BMSCs细胞,体外培养鉴定.实验分为5组:对照组(Control)、氧糖剥夺-复氧组(OGD)、PKD1组、AMD3100(CXCR4的特异性阻断剂)组和AMD3100-PKD1组.CCK-8法检测BMSCs的存活率,Tunel法检测BMSCs的凋亡情况,BrdU法检测BMSCs的增殖能力,Transwell法检测BMSCs的迁移能力,RT-PCR法检测BMSCs中CXCR4的mRNA表达,Western blot法检测CXCR4的蛋白表达.结果:PKD1预处理可明显提升BMSCs的存活、增殖和迁移能力(P0.05),减少BMSCs的凋亡数量(P0.05);并上调BMSCs中CXCR4 mRNA和蛋白的表达(P0.05).阻断剂AMD3100可降低PKD1预处理后BMSCs的存活、增殖和迁移能力,增加BMSCs的凋亡数量,下调BMSCs中CXCR4 mRNA和蛋白的表达,从而减弱PKD1对BMSCs的预处理作用.结论:PKD1可能通过调控CXCR4的表达发挥抗氧糖剥夺-复氧作用:减少BMSCs的凋亡,提高BMSCs的存活、增殖和迁移能力.     

胶原-壳聚糖复合支架体外三维培养神经干细胞

采用冷冻干燥法制备了胶原-壳聚糖复合支架并通过层粘连蛋白（LN）进行结构修饰,测定其物理性能特征,建立了胎鼠海马神经干细胞（NSCs）的三维培养体系,同时考察了NSCs与胶原-壳聚糖复合支架的生物相容性．孔径、孔隙率、吸水率、降解率等参数的比较表明,体积比为7：3的复合支架更适合于体外细胞培养的要求,并且NSCs在经LN修饰后支架材料上的接种率得到明显提高;激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察表明,NSCs能够在胶原-壳聚糖复合支架内良好地生长、增殖及分化．这些结果为NSCs的进一步临床移植应用,以及治疗神经系统疾病的新药筛选和机理研究等奠定了坚实的实验基础．     

三维丝素蛋白/羟基磷灰石支架的生物学性能

综合运用丝素蛋白纤维网的非编织制作方法和仿生矿化法,构建三维多孔丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合支架.通过体外蛋白酶降解和成骨细胞培养,对支架材料的生物学性能进行初探.发现蛋白酶对丝素蛋白降解的作用大小依次为,蛋白酶K＞胰蛋白酶＞α-糜蛋白酶＞Ⅰ型胶原酶.所构建的支架显示出良好的生物相容性并能促进成骨细胞生长和分化.三维多孔丝素蛋白/纳米羟基磷灰石支架可望成为新型有机/无机复合生物材料,为骨组织工程支架的设计提供了新的思路.     

人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化的研究

目的:探讨早孕蜕膜组织分离子宫内膜间质干细胞及子宫内膜间质干细胞向子宫内膜分化的方法.方法:胶原酶Ⅰ法消化早孕人流子宫蜕膜组织,贴壁法分离子宫内膜间质干细胞,传代纯化至第2代,流式细胞仪检测其表面抗原.细胞免疫组织化学法检测角蛋白(CK)、波形蛋白(VIM)的表达.取第2代细胞,接种于24孔培养板爬片.实验分两组:单纯培养基组,细胞因子组即分别加入质量浓度均为10 ng/mL TGF-β、EGF与PDGF-BB.培养至第6天,采用免疫细胞化学法检测子宫内膜上皮标记物CK18和间质标记物VIM的表达.结果:胶原酶Ⅰ酶消化后贴壁培养法能稳定从人早孕蜕膜组织中分离出子宫内膜间质干细胞;子宫内膜间质干细胞不表达CD34、CD45、CK,强表达CD73、CD90、HLA-I;细胞免疫化学法检测干细胞CK阴性,VIM阳性.细胞免疫化学染色提示生长因子组CK阳性,VIM阳性,而对照组CK阴性,VIM阳性.结论:胶原酶法能有效从早孕蜕膜组织中分离出子宫内膜间质干细胞,且子宫内膜间质干细胞能向子宫内膜上皮细胞分化.     

胶原修饰快速成形PLGA/TCP人工骨支架体外生物相容性研究

探讨经Ⅰ型胶原修饰的快速成型(RP)聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙(PLGA/TCP)支架的生物相容性,为进一步体内实验提供研究基础.以经Ⅰ型胶原修饰改性的PLGA/TCP支架作为实验组,未经胶原修饰的原始支架作为对照组,检测两组支架材料的亲水性.BMSCs接种两组支架,分别测定细胞黏附率、细胞增殖率.扫描电镜(SEM)观察细胞黏附形态,以检验支架材料的细胞相容性.结果表明胶原改性支架具有较高的亲水性,实验组细胞黏附率在接种4、8和12 h者,明显优于对照组(P<0.05).实验组在培养2、4、6和8 d的细胞增殖率也明显高于对照组(P<0.05).扫描电镜可见骨髓基质细胞在实验组支架上的增殖数量多于对照组.说明Ⅰ型胶原改性的PLGA/TCP支架具有良好的细胞生物相容性,可作为骨组织工程支架应用于骨缺损的修复研究.     

人足月胎盘间充质干细胞的分离纯化及其特征

目的:从人足月胎盘中分离、培养间充质干细胞(MSCs),并研究其生物学特征.方法:将人足月胎盘组织经胶原酶Ⅱ消化和贴壁培养法获取间充质干细胞,运用活细胞计数和碘化丙啶(PI)检测其增殖能力;采用流式细胞术检测其细胞表面标志的表达;用地塞米松、抗坏血酸及β-磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用Yon Kos-sa染色进行鉴定;用地塞米松与胰岛素诱导其向脂肪细胞分化,并以油红O染色进行鉴定.结果:从人足月胎盘分离的间充质干细胞为梭形贴壁细胞,增殖能力较强;强表达CD44、CD29,不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR;经诱导后向脂肪细胞及成骨细胞分化,油红O染色、Von Kossa染色为阳性.结论:人足月胎盘中也富含间充质干细胞,与其他来源的间充质干细胞的生物学特征相似,可能是组织工程新的干细胞来源.     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养方法的建立

为建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养的方法,为后续细胞共培养奠定实验基础。采用通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,进行形态学观察,并应用流式细胞术检测BMSCs免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的第三代BMSCs向脂肪细胞和成骨细胞方向进行诱导分化,诱导21 d后的脂肪细胞应用油红O染色进行鉴定,成骨细胞应用茜素红染色进行鉴定;将获取的骨髓细胞液按照造血系单核干细胞诱导培养法向破骨细胞方向进行诱导分化,于28 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色进行鉴定。结果显示,BMSCs体外培养14 d具有独特的细胞免疫学表型,流式细胞术检测,CD29+、CD44+表达量分别为97.92%和89.32%;在脂肪培养基诱导下,油红O染色阳性。在成骨培养基诱导下,茜素红染色阳性;骨髓细胞液在破骨培养基诱导下,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。由此可知,建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞诱导分化的培养方法。     

精原干细胞体外培养的方法改进

探讨精原干细胞体外培养优化方法,为进一步探讨其生物特征、生殖干细胞移植及生殖损伤及药物保护等研究提供实验基础.制备骨髓基质饲养层,将生后5 d~7 d雄性小鼠生精细胞接种在饲养层上,并于IMDM培养基及37 ℃下共培养,在倒置显微镜下观察细胞生长行为,并对培养后的细胞进行组织学、细胞化学、免疫组化、遗传学鉴定.精原干细胞能在以骨髓基质细胞饲养层上进行增殖和生长,且增殖后的表现出呈簇、团状生长,细胞间可表现出明显的胞质间桥,细胞核大,核/质比高,碱性磷酸酶及C-KIT受体阳性,染色体核型为20对(40条)等精原干细胞的生物学行为特征.原代培养的骨髓基质细胞作饲养层具有取材及制作简便等优点,且能在不添加外源性生长因子的前提下能通过自分泌足够的细胞生长因子,满足精原干细胞体外增殖和抑制分化的需要,是精原干细胞培养的一种良好的饲养层.IMDM培养基、血清及适宜的环境温度是精原干细胞体外培养的重要条件.     

电气石/水凝胶复合材料体外细胞相容性评价

为检测电气石的体外细胞相容性,将电气石粉按不同的比例复合到水凝胶中并与人成骨肉瘤MG63细胞共培养,采用光镜、荧光染色、MTT法评价电气石的体外细胞相容性.实验结果表明,人成骨肉瘤MG63细胞与不同含量电气石/水凝胶复合材料共培养均能够正常生长增殖且形态良好,电气石所具有的良好体外细胞相容性可用作组织修复材料.