细胞周期蛋白质依赖性激酶CDK2多克隆抗体的制备和鉴定

我们采用PCR技术合成编码CDK2肽段的基因,将其置于谷胱甘肽转移酶（GST）编码基因的下游,在IPTG诱导下,于E．coli中诱导表达了GST-CDK2肽融合蛋白质,以此融合蛋白质作为免疫原免疫家兔制备抗CDK2的多克隆抗体,经Western Blot检测证明：该抗体能够特异地识别CDK2蛋白质,可作为CDK2的特异性检测抗体,用于研究细胞周期和细胞凋亡进程中CDK2的作用．     

胆酸钠多克隆抗体的制备及其快速检测方法研究

目的:探索用胶体金免疫层析法快速检测胆酸钠含量。方法:用碳二亚胺法合成的免疫抗原胆酸钠-BSA,免疫新西兰白兔,制备抗胆酸钠多克隆抗体。用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定特异性抗体效价。制备胆酸钠—OVA抗原—胶体金复合物,组装检测试纸。结果:胆酸钠抗体的效价为1∶80 000,建立的胶体金快速测定法对胆酸钠的检测限为12μg/mL。结论:试纸条法是快速检测胆汁酸含量的有效方式,在临床检测方面具有广阔的运用前景。     

德国小蠊Bla g 2的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用RT-PCR技术扩增德国小蠊Blag2基因,将其克隆进pET-41b载体.在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-Blag2蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,得到相对分子量约74kDa的融合蛋白.通过亲和层析法纯化表达的GST-Blag2蛋白,并以此表达产物制成油乳剂疫苗免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体.间接ELISA法测得抗体效价达到1∶300000.Western印迹表明抗体有较高的特异性,可分别与GST-Blag2融合蛋白和德国小蠊变应原浸提液反应.Blag2在大肠杆菌中的成功表达及其多克隆抗体的制备,为德国小蠊过敏患者的诊断和治疗提供了帮助.     

三聚氰胺多克隆抗体的制备及鉴定

用三聚氰胺偶联蛋白为抗原,按不同的时间规律及抗原剂量对成年兔进行免疫,获得特异性的三聚氰胺多克隆抗体.效价检验应用蛋白质电泳和间接ELISA方法.应用10%及12.5% SDS-PAGE,验证血清中IgG抗体的产生情况,再用间接酶联免疫吸附试验测得第4次免疫后抗体效价达到1.2×107.此法易于实施,且获得的血清样品具有较高的效价,为今后三聚氰胺多克隆抗体的分离纯化提供了可靠的实验依据.     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

一种免疫小鼠制备大量多克隆抗体的新方法

研究了一种用纯抗原免疫小鼠,在抗体产生时注射腹水癌细胞,最后取其腹水(含抗体)的多克隆抗体制备方法,免疫1只小鼠共需免疫抗原60～300μg,可获得15～30mL腹水抗体.此法既适合于大分子质量抗原,也适合于小分子质量抗原.用ELISA、免疫印迹、免疫滴定等方法检测抗体效价、特异性、结合力等,均得到满意的结果.此种抗体在-20或-70℃最少能保持稳定1a以上.     

斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

在心脏发育过程中,相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键．斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因．生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸,含有一个CXXC结构域．为进一步研究该基因的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因．将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中,经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达出pET-28a－CFL融合蛋白,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71％,融合蛋白相对分子质量约为30kD．经包涵体纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体．经验证,具有较好的特异性和较高的效价,可以用作western－blot免疫印迹等实验分析．     

盘基网柄菌allC的克隆、表达和多克隆抗体的制备

运用RT-PCR技术从盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)总mRNA中克隆到了尿囊酸酶基因(allC),该基因编码区开放读框长1 100bp,编码的蛋白约42kD.由于是在野生型和突变型细胞中差异表达的片段,表明该基因在盘基网柄菌多细胞发育中起到重要作用,因此将allC克隆入融合表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达带有6个组氨酸标签的尿囊酸酶(ALC)融合蛋白,经镍柱亲和层析,获得了电泳纯蛋白.用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.ELISA测得制备的抗ALC蛋白的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,Western Blotting检测证明该抗体有较强的针对ALC蛋白的专一性.这些数据表明重组质粒表达的ALC融合蛋白具有良好的抗原性,制备ALC的多克隆抗体有良好特异性和效价,能够满足针对ALC免疫印迹和细胞内定位检测等实验要求,为深入研究ALC蛋白在盘基网柄菌多细胞发育的功能作用提供了有力工具.     

碘化酪蛋白多克隆抗体的制备

碘化酪蛋白（Iodinated Casein）是一种蛋白同化类激素,为甲状腺素的前驱物质,具有类似甲状腺素的生理作用．2002年被农业部第176号公告列入禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物．     

程序性细胞死亡配体1胞外区原核重组表达、纯化及其多克隆抗体制备

为制备程序性细胞死亡配体1胞外区多肽及其鼠源性多克隆抗体,根据UniProtKB数据库中公布的其胞外区基因序列(标识符:Q9NZQ7-1)和原核表达载体pET-28a(+)Nde I上游和Xho I位点下游的序列,设计合成带有同源臂的特异性引物.以合成的PD-L1胞外区基因为模板,PCR扩增程序性细胞死亡配体1胞外区基因并将其克隆至pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-PD-L1-E,转化至大肠杆菌DH5α中,扩增并提取其质粒,然后将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达.亲和层析镍柱纯化重组蛋白后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,确认表达蛋白正确.浓缩换液后用重组蛋白免疫Balb/c品系小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测,成功获得抗程序性细胞死亡配体1胞外区血清.该研究对于研发某些肿瘤伴随诊断检测试剂有重要意义.     

锌指蛋白ZNF191(243-368)G321A;N324L;G321A/N324L突变体的制备和表征

通过分子生物学的蛋白质工程方法对锌指蛋白ZNF191(243—368)的第三锌指区(Gly321和Asn324进行了定点突变，在大肠杆菌BL21中表达，通过DEAE52，CM23，肝素柱CL-6B纯化，最终获得了ZNF191(243—368)(G321A；N324L；G321A／N324L等3个突变体蛋白，运用凝胶电泳、UV光谱、EDTA滴定、金属离子(Co^2’，Ni^2 )取代等方法对突变体蛋白进行了初步表征，这为今后进一步研究该蛋白的结构和功能提供了必要的物质基础。     

AK078438基因原核表达载体构建、多克隆抗体制备

AK078438基因是一个功能未知的新基因.通过RT-PCR方法扩增出AK078438基因的全长开放阅读框,构建了AK078438基因的原核表达载体.经诱导表达,亲和层析纯化该基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.ELISA和Western blot结果表明我们成功的制备了AK078438基因的抗体,为后续该基因功能的研究做好了准备.     

氯霉素多克隆抗体的制备及特性分析

为了建立快速检测氯霉素(CAP)的免疫学方法,采用重氮法、混合酸酐法与碳二亚胺法(EDC)法分别合成氯霉素完全抗原,并通过稳定性比较实验确定采用混合酸酐法合成的氯霉素卵清蛋白(CAP-OVA)免疫BMb/C小鼠,制备抗血清,采用EDC法制备的氯霉素牛血清白蛋白(CAP-BSA)作为检测抗原,用ELISA方法进行鉴定与特性分析.结果显示该多抗与常见抗生素的交叉反应率均小于0.01%,IC50为18.53 ng/mL,灵敏度达到0.53ng/mL,该抗体可用于氯霉素的快速检测.     

利用多克隆抗体检测纺锤体蛋白基因INMAP在肝癌细胞中的表达

 为探究纺锤体蛋白INMAP 的功能及其在细胞恶性增殖中发挥的作用,制备INMAP 多克隆抗体.利用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导His-INMAP 融合蛋白进行原核表达,SDS-PAGE 及免疫印迹检测蛋白表达.4.0 mol/L 尿素处理包涵体获得可溶性融合蛋白,镍亲和柱分离纯化融合蛋白抗原并检测蛋白浓度及纯度.以所获抗原免疫4 只Balb/c 小鼠,收集心脏抗血清.以纯化前、后的原核表达产物作为抗原,检测INMAP 多克隆抗体的特异性.通过免疫印迹分析INMAP 在正常肝细胞系L-02 及5个肝癌细胞系(PLC、HepG2、SUN449、SMMC-7721 和BEL-7402)中的表达差异.结果显示,His-INMAP 融合蛋白主要以包涵体形式存在,经4.0 mol/L 尿素处理可获得可溶性目的蛋白,且纯化后的抗原纯度较高(94.1%).INMAP 多克隆抗体能与INMAP 抗原特异结合.INMAP 在6 种肝细胞中具有多态性,除PLC 外,在其他肝癌细胞中其基因表达水平显著下调.本研究制备的INMAP 多克隆抗体特异性高,为INMAP 基因功能的进一步研究奠定了基础.     

人类锌指蛋白新基因ZNF641的克隆及表达

从人类心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个新的人类锌指基因ZNF641,该基因的cDNA序列全长4．9kb,编码一个含438个氨基酸的蛋白质,从进化上看,该蛋白质在从小鼠到人的脊椎动物中都高度保守．Northern Blot分析显示：ZNF641在人类的多数组织中都有表达,尤其是在骨骼肌中有较高水平的表达．而亚细胞定位则显示ZNF641在细胞核及细胞质中均有定位．     

hUPF1的两个功能位点对调控ZNF268基因转录活性的影响

h UPF1是人类无义介导mRNA降解途径的关键因子,前期研究结果显示h UPF1能够调控ZNF268基因的转录活性.为研究h UPF1的两个功能位点对调控ZNF 268转录活性的影响,使用双荧光报告实验体系,在He La细胞中转染R1R-DE637AA、R1R-RR857AA或质粒组合,然后测量ZNF 268启动子报告质粒p GL3(-37/1234)和p GL3(589/760)的活性.结果显示h UPF1的任何一个功能位点缺失都导致ZNF 268转录活性下降.为排除内源性h UPF1对实验结果的影响,使用RNA干扰的方法降解内源性h UPF1,再转染R1R-DE637AA或R1R-RR857AA质粒.实验结果得到进一步证实.研究表明h UPF1的两个功能位点对调控ZNF 268基因的启动子活性都是必要的.