马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因5''''端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV—Ch的RNA为模板，经反转录PCR扩增，将获得ORF2a的5′端0．6kb cDNA克隆于pUC19中，构建成重组质粒pLR8．PCR检测和酶切检测表明，获得了ORF2a的5′端0．6kb cDNA克隆，从该cDNA两端进行了两次序列分析，并将获得的核苷酸序列与国外报道的4个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较，5个序列间具高度同源性。     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因5′端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV-Ch的RNA为模板,经反转录PCR扩增,将获得ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆于pUC19中,构建成重组质粒pLR8.PCR检测和酶切检测表明,获得了ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆,从该cDNA两端进行了两次序列分析,并将获得的核苷酸序列与国外报道的4个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较,5个序列间具高度同源性.     

苜蓿花叶病毒复制酶基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以侵染苜蓿的苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV—Ch)RNA2为模板，利用人工合成的特异性引物，进行反转录及PCR扩增，分两段分别扩增了复制酶基因的5′端1．32kb和3′端及其非编码区的1．23kb cDNA序列．用限制性内切酶切割PCR产物后，与pUCl9重组，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒，用限制性内切酶分析及PCR鉴定，得到分别含有5′端序列和3′端序列的重组质粒。已由上述两种重组质粒构建了含有完整复制酶基因的重组质粒．进行了全序列测定，并与国外报道的A1MV-425株系的相应序列相比较，其复制酶基因编码区核苷酸序列同源性达97．8％，推测的氨基酸序列的同源性达97．6％，3′端非编码区核苷酸序列同源性为98．2％．并将全长复制酶基因与植物表达载体pROKⅡ重组，得植物转化载体pAlMV—FL．     

RLM-RACE法快速克隆盐角草胆碱单加氧酶cDNA 5′末端全序列

采用RLM-RACE法,根据已获得的盐角草胆碱单加氧酶基因的部分序列,设计2条特异性嵌套PCR引物,成功地克隆了该基因cDNA 5′末端全序列,测序结果显示该片段包括5′UTR 154个核苷酸和编码区606个核苷酸,编码N端202个氨基酸,Blast P结果表明,该片段编码的蛋白序列与辽宁碱篷及其他藜科植物的胆碱单加氧酶同源性达到85％以上,同时找出了其转录起始位点,即为该序列的第1个碱基g．     

新疆加工番茄条斑坏死病原黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从表现花叶、畸形以及坏死症状的加工番茄病株上获得黄瓜花叶病毒分离物，用1对CMV CP基因引物进行RT-PCR，扩增得到了776bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物插入到克隆载体PUCm-T中转化大肠杆菌DHSa。经限制酶酶切鉴定，重组克隆中含有与PCR产物大小相同的776bp的插入片段。cDNA全序列分析表明，重组克隆含1个开放阅读框架（ORF），长度为657nt，编码218个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的核苷酸同源性高达91．0％-98．9％．而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在76．4％-78．2％，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的氨基酸同源性高达94．2％-98．6％；而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在79．9％～83．5％．CMV亚组Ⅰ的株系较CMV亚组Ⅱ株系同源关系更密切，所以CMV新疆分离物应该归属于CMV亚组Ⅰ。     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA的克隆和序列分析

以甜瓜品种河套蜜瓜成熟果实mRNA为模板，经反转录合成和PCR扩增得到编码多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)基因全长cDNA，将其克隆于pUC19质粒中获得重组质粒pCMPG．此cDNA长1183bp，包括一个393个氨基酸残基组成的开放阅读框架，与已报道的甜瓜PG基因cDNA核苷酸序列比较同源性为99．3％，相应的氨基酸的同源性为98．5％．     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5′调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物,寡聚核苷酸序列的上游引物为5-′gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3;′下游引物为5-′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后,分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5′调控区1 447 bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明,青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97.65%,云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96.8%,青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99.4%。     

日本脑炎病毒(JEV)内蒙古分离株M73-1 E基因的5'端克隆及部分序列分析

根据国外报道的JEV(Japanese encephalitis virus)基因组全序列,针对JEV E基因5'端设计合成一对特异引物,以日本脑炎病毒内蒙古分离株 M73-1 RNA 为模板,经RT-PCR扩增,获得366 bp的JEV E基因cDNA片段.将此片段重组于质粒pUC 19中,并转化大肠杆菌DH5α.经PCR扩增,酶切及序列分析,结果表明JEV M73-1 5'端126个核苷酸序列与JEV日本Nakayama株和JaOArS 982株的同源性分别为96.8%和96.8%,氨基酸序列同源性均为99.2%.通过对病毒基因组结构分析从分子水平上进一步证实了1973年在呼和浩特市流行的脑炎是由JEV引起的流乙脑炎.E基因编码JEV的囊膜糖蛋白,是其重要表面抗原.JEV M73-1 E基因5′端克隆和部分序列分析对JEV的分子生物学研究、建立分子生物学诊断技术以及基因工程疫苗的研制均具有重要学术意义和实际价值.     

苜蓿花叶病毒RNA2 3''''端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1／2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV-Ch)RNA：3′端cDNA，重组到植物表达载体pROKⅡ中，通过致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，以叶圆片为转化材料，转化普通烟草，并获得了转基因植株．经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明．AIMV RNA：3′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性．     

日本脑炎病毒(JEV)内蒙古分离株M73-1E基因的5′端克隆及部分序列分析

根据国外报道的 JEV( Japanese encephalitis virus)基因组全序列 ,针对 JEV E基因 5′端设计合成一对特异引物 ,以日本脑炎病毒内蒙古分离株 M73-1 RNA为模板 ,经 RT-PCR扩增 ,获得 366bp的 JEV E基因 c DNA片段 .将此片段重组于质粒 p UC1 9中 ,并转化大肠杆菌DH5α.经 PCR扩增 ,酶切及序列分析 ,结果表明 JEV M73-1 5′端 1 2 6个核苷酸序列与 JEV日本 Nakayama株和 Ja OAr S982株的同源性分别为 96.8%和 96.8% ,氨基酸序列同源性均为 99.2 % .通过对病毒基因组结构分析从分子水平上进一步证实了 1 973年在呼和浩特市流行的脑炎是由 JEV引起的流乙脑炎 .E基因编码 JEV的囊膜糖蛋白 ,是其重要表面抗原 .JEV M73-1 E基因 5′端克隆和部分序列分析对 JEV的分子生物学研究、建立分子生物学诊断技术以及基因工程疫苗的研制均具有重要学术意义和实际价值     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV—NM)提取总RNA，经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段，并构建至pGEM—T载体中。序列测定后，将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析：同源性为40％。通过PCR法标记克隆的cDNA片段，制备地高辛标记探针，与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交，并作敏感性试验，结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性，可检测出50pg的病毒RNA。     

产气荚膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析

利用PCR技术，从C型产气荚膜梭茵中国标准株C59-44基因组DNA中扩增出了约0．7kb的基因，并将其克隆到pGEM-T栽体上，经酶切鉴定及核苷酸序列分析表明，该基因片段的核苷酸序列与国外报道的β2毒素基因序列一致．     

水稻黑条矮缩病毒基因组第九组分cDNA的克隆及序列分析

从我国发病的玉米材料中提取水稻黑条矮缩病毒,抽提病毒RNA,利用RT-PCR等手段,获得了病毒基因组第九组分（S9）cDNA克隆。序列分析结果表明：S9全长1900bp,含有2个不重叠的ORF,编码蛋白的分子质量分别为39.9,24.2ku,与日本株S9核苷酸序列同源性为89%,与意大利株MRDV S8同源性为86%。     

我国不同地域牦牛BLG基因部分核苷酸序列同源性分析

设计一对PCR引物，寡聚核苷酸序列的上游引物为5’-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’，下游引物为5’-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACC，TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后，分别克隆了来自我国甘肃、青海和云南地区牦牛β乳球蛋白基因的5’调控区1447bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，甘肃牦牛与青海牦牛该序列的核苷酸同源性为98、13％，与云南牦牛该序列的核苷酸同源性为97．65％，青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99．45％。     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5''''调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物，寡聚核苷酸序列的上游引物为5’-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’；下游引物为5’-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACC，TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后，分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5’调控区1447bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMD1S-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97．65％，云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96．8％，青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99．4％。     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5''端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northern blot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50 pg的病毒RNA.     

PRV广东株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据伪狂犬病病毒（PRV）Rice株gE基因的序列设计并合成了1对引物,以我国PRV地方毒株广东株的基因组DNA为模板,通过PCR方法获得了一大小约1.6kb的DNA片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序,序列测定结果显示,该片段长1665bp,编码555个氨基酸,与PRV Rice株gE基因的核苷酸序列同源性为97.7%,氨基酸序列同源性为95.9%。     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP_2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50pg的病毒RNA.     

马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因5′上游调控区的分离和序列分析

利用单一特异引物聚合酶链反应技术，将马铃薯ＤＮＡ中天冬氨酸蛋白酶抑制剂家族一成员的５′上游区分离，并克隆进ｐＵＣ１８质粒ＳｍａＩ位点中．用３２Ｐ中标记的单一特异引物──ＰｒｉｍｅｒＡ为探针，经斑点杂交得一阳性克隆．ＤＮＡ测序获得含有马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因５′上游区的插入物的核苷酸序列．从这序列结构中见到ＴＡ富含区，并发现典型的调控序列ＴＡＴＡ和ＣＡＡＴ．此上游序列与国外所得到的天冬氨酸蛋白酶抑制剂的上游区相比较在序列和ＴＡＴＡ及ＣＡＡＴ盒的位置上有着很大的不同．     

人乳铁蛋白基因克隆及表达载体构建

通过ＰＣＲ法扩增出２３６６bp的人乳铁蛋白cDNA、８００bp的山羊β－乳球蛋白基因５′端调控序列,经ＰＣＲ反应连接后,克隆到表达载体pLNCX中,测序结果表明,与ＧeneBank中登录的序列相比,所获人乳铁蛋白cDNA序列的同源性为９９．７４％,山头β－乳球蛋白基因５′端调控序列的同源性为９９．７５％。酶切结果证明得到了正确的重组载体,可用于乳腺生物反应器的研究。利用ＰＣＲ反应直接克隆目的片段,并通过同源序列进行ＰＣＲ连接,极大提高了克隆的速度和准确性,,为基因克隆及其表达研究带来了方便。