亲和层析分离经胃蛋白酶水解后的猪胰蛋白酶活性产物

猪胰蛋白酶经胃蛋白酶有限度地水解后的活性产物可以用大豆胰蛋白酶抑制剂STI-Sepharose亲和层析方法分离出三种形式的活性分子:K~(**) ,λ~(**)和μ~(**)胰蛋白酶。三者的分子量与母体酶分子β-胰蛋白酶的分子量相同。它们与特异性底物反应时,三者的活性各异。N末端基测定,表明三者N末端氨基酸的不均一性。结果说明,猪胰蛋白酶经胃蛋白酶水解后在一至两个肽键处发生断裂,由于分子内二硫键的连接,并未导致胰蛋白酶肽链的脱落。     

重组绿豆胰蛋白酶抑制剂片段对肠癌细胞SW480迁移的影响

探讨重组胰蛋白酶抑制剂活性片段(LysGP33)的抗肠癌效应.大肠杆菌原核表达LysGP33活性片段,GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化.MTT比色和细胞划痕方法检测LysGP33活性片段对SW480细胞增殖和迁移的影响.结果表明:10 μmol/L LysGP33活性片段对SW480细胞的增殖活性无明显影响,但能够有效地抑制SW480细胞的迁移,并呈现时间依赖效应.绿豆胰蛋白酶抑制剂抑制了肠癌细胞的迁移,在抗肿瘤浸润和转移中具有一定的应用前景.     

具有抑制糖苷酶和胰蛋白酶双重活性的亚麻多肽的大肠杆菌重组表达及其活性分析

亚麻胰蛋白酶抑制剂(Linum usitatissimum L.LUTI)是亚麻中一种兼具胰蛋白酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂双重活性的多肽。文章将LUTI基因连接在pGEX-6p-1载体上获得重组载体pGEX-6p-1-LUTI,转化至大肠杆菌菌株E.coliBL21(DE3)表达,经GST-Sepharose4B、Prescission Protease酶切GST标签、Sephacryl S-200凝胶层析,获得分子量大小为8kDa电泳纯的重组LUTI(rLUTI)。经抑制活性测定,相比天然的LUTI,rLUTI对胰蛋白酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性明显提升。二硫键存在与否对两种酶的抑制活力均有影响。利用定点突变技术获得rLUTI的C4/A,C49/A,C4、49/A突变体,进一步双酶抑制活性及CD结构分析显示,rLUTI的C4/A、C49/A及C4、49/A突变体对胰蛋白酶抑制活性影响尤为明显,α-葡萄糖苷酶的抑制活性略微下降;其中rLUTI的C49/A及C4、49/A突变体完全丧失了对胰蛋白酶的抑制活性。C4/A的突变对rLUTI的二级结构影响最为明显,导致α螺旋结构含量的降低。以上结果表明rLUTI第4位氨基酸Cys是影响其二级结构的关键位点,第49位氨基酸Cys则在维持其双酶抑制活性上发挥着重要作用,特别在胰蛋白抑制活性方面尤为突出。     

重组大豆KUNITZ型胰蛋白酶抑制剂Tid的大肠杆菌表达及抑制活性研究

利用大肠杆菌高效表达系统表达大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SBTi—A2)Ti^d,并利用亲和层析的方法纯化得到有抑制胰蛋白酶活性的SBTi^d．对重组SBTi^d的pH稳定性和温度稳定性与天然SBTi^d进行了比较研究.结果表明重组SBTi^d在高pH下具有更好的稳定性,预示了SBTi^d作为生物农药或利用转基因方法提高作物抗虫性的应用前景．     

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( )中构建重组表达质粒pET25b ( )/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L.     

猪胰蛋白酶及其自溶活性产物的圆二色性研究

用圆二色性谱(CD谱)研究了猪胰蛋白酶及其自溶活性产物在溶液中的构象,并观察了在十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中酶分子构象的变化。 猪胰蛋白酶的CD谱显示有相当量的α-螺旋成份及少量β-折叠成份,它在190nm附近的[θ]值远大于牛胰蛋白酶。其自溶活性产物的CD谱显示α-螺旋的成份减少5—6％,β-折叠成份上升3—6％,而有序部分所占比例基本不变,提示自溶后α-螺旋转化为β-折叠。 在SDS溶液中,α-螺旋和β-折叠在胰蛋白酶分子中所占的比例提高,而α-螺旋成份增加更为明显,表明酶分子的有序度提高。 参照Chou与Fasman以及Chen,Yang与Martinez等人的方法,预测猪胰蛋白酶有36％的氨基酸残基可以形成α-螺旋,由实测CD谱计算,亦在37％左右,两者相符。     

猪胰蛋白酶自溶后的活性产物

酶的催化作用起因于分子中某些部位氨基酸残基的特定空间结构,即“活性部位”的存在。使酶分子发生有限度的降解,观察它对酶活性的影响,乃至分离出具有酶活性的降解产物——“活性碎片”,这是研究酶的结构与功能的关系的方法之一。在这方面,胰蛋白酶特别引人注意,因为在一定条件下,无需外加蛋白酶,胰蛋白酶本身就能发生自溶作用;同时胰蛋白酶的高度的专一性对于确定肽链断裂的位置也是很有帮助的。     

土元溶栓蛋白的原核表达和活性检测

本文利用兼并引物成功克隆到土元类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因,通过构建该基因的原核重组表达载体及IPTG体外诱导,包涵体蛋白复性,Ni 2+柱亲和层析纯化,最终获得了重组表达目的蛋白.经体外检测,该蛋白具有较好的溶栓活性,这为揭示土元溶栓作用的分子基础及其进一步的开发利用奠定了基础.     

(A11,A12)胰岛素原移位突变体的表征研究

将(CysA11Ser,SerA12Cys)人胰岛素原移位突变体基因克隆至高效表达质粒pET22b多克隆位点区,构建重组表达质粒pET-A112,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLys中进行了表达.表达产物存在于包涵体中,通过包涵体的分离及二硫键变复性,获得A6-A12二硫键突变型的胰岛素原突变体.SDS-PAGE电泳显示突变型胰岛素原的电泳迁移率与野生型胰岛素原基本相同.质谱检测表明,突变性胰岛素原的分子结构均一、纯度良好,氨基酸组成与理论值基本一致.以野生型人胰岛素原为对照进行的胰岛素受体试验及胰岛素放射免疫试验表明,A6-A12二硫键错接型胰岛素原突变体的受体结合活性和放免活性是野生型胰岛素原的11%与55%.     

活性胺单体对紫外光固化涂料氧阻聚效应抑制作用的研究

本文研究了活性胺单体对紫外光固化涂料氧阻聚效应的抑制作用，结果表明：抑制作用是由于胺类分子中具有活性α－Ｈ，胺类分子结构中供电子取代基对α－Ｈ有致钝作用，吸电子取代基能使α－Ｈ致活；同时，胺类分子迁移至表面的能力对抑制氧阻聚效应作用有显著影响．