杨树MAGPIE和JACKDAW基因克隆、表达及蛋白互作研究

利用RACE技术从杨树不定根中克隆获得PeMGP和PeJDK基因全长cDNA序列,分别包含1 434 bp和1 518 bp长度的开放阅读框。两者都含2个内含子,其氨基酸序列均有4个保守结构域:2个C2H2型锌指结构域ZF1(CX2-4CX3FX4LX2HX3-5H)和ZF2(CX4CXnHXnX4H),2个C2HC型锌指结构域ZF3(CX2CXnHX3C)和ZF4(CXCXnHX3C)。在根茎叶中均检测到PeMGP和PeJKD基因的表达,但它们在杨树不定根发育过程中具有动态的表达模式。杨树原生质体瞬时表达揭示,PeMGP和PeJDK蛋白都定位于细胞核,两者在细胞核发生相互作用。     

一个麻疯树C2H2型锌指蛋白基因JcZFP1的克隆与表达分析

从麻疯树胚乳cDNA文库中克隆得到一个C2H2型锌指蛋白基因,JcZFP1,全长931bp,开放阅读框全长735bp,编码244个氨基酸残基,等电点pI=7.0,分子量PA=27.38kD.C2H2型锌指结构位于第81至103个氨基酸残基中,包括植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH.在该基因的顺式作用元件上发现了与生长发育和逆境胁迫相关的启动元件.荧光定量PCR(qPCR)检测发现,JcZFP1基因在麻疯树各器官中的表达量依次为:绿果皮花叶根茎种仁,且幼嫩器官表达量高于成熟器官;对麻疯树幼苗进行低温、干旱胁迫时,JcZFP1基因的表达量明显增加,表明该基因可能在麻疯树的生长发育及逆境胁迫应答过程中起重要作用.     

小鼠胚胎脑特异表达的新基因bsg3的克隆及初步研究

通过消减差异筛选的方法克隆到一个在小鼠胚胎脑特异表达的基因bsg3(brain specific gene 3).它编码的蛋白与人的KIAA0961具有80.3%的同源性.bsg3基因包含一个1644bp的完整阅读框,编码一个含548个氨基酸,具有1个KRAB结构域(kruppel-associated box)和13个C2H2型锌指结构域的蛋白.该基因定位在小鼠第7号染色体上,包含5个外显子,4个内含子.以bsg3基因全长编码区为探针的原位杂交结果显示,bsg3在小鼠胚胎脑及鸡胚脑特异表达.半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的结果表明,在成体小鼠的组织中,bsg3基因脑中表达也较强.这提示bsg3基因可能在小鼠脑发育中起着重要的作用.对bsg3基因时间和空间的表达模式的分析将有助于进一步揭示它在脑发育及功能维持中的作用.     

甘蓝型油菜CCCH基因BnaA07g26050D的克隆及表达分析

油菜是我国重要的油料作物,它的产量受到各种逆境胁迫的影响.我们之前的研究表明,拟南芥CCCH锌指蛋白At C3H14控制植株生长发育的诸多过程.在本研究中,我们证实甘蓝型油菜CCCH基因Bna A07g26050D(At C3H14的同源基因)响应盐胁迫和干旱胁迫.Bna A07g26050D蛋白C端包含两个串联的CX8CX5CX3H结构域,在酵母中具有转录激活活性,类似于At C3H14.将Bna A07g26050D融合GFP转化拟南芥原生质体,发现其主要定位于细胞质和P-body中.qRT-PCR检测Bna A07g26050D基因的组织表达模式,结果表明该基因主要在上部茎、根和花中大量表达,而在其他组织中表达较低.此外,qRTPCR证实Bna A07g26050D基因在盐胁迫和干旱胁迫下表达量都明显上调,证明该基因可能参与干旱和盐胁迫.我们的研究为利用基因工程技术培育耐盐、旱油菜新品种提供了基因源.     

人源锌指蛋白ZNF24及其锌指结构域的表达、纯化及DNA结合性质的研究

转录因子是调控基因表达的关键蛋白，能够以序列特异性方式结合DNA。ZNF24是Krüppel-like锌指转录因子家族成员之一，在细胞增殖和分化中起重要作用，能促进肝癌细胞的增殖，抑制神经元细胞的分化。ZNF24蛋白N端包含一个SCAN结构域，C端为锌指区，由4个串联的C2H2型锌指结构组成。ZNF24能特异性识别和结合基因的启动子，参与基因的表达调控，但其发挥功能的具体分子机制并不清楚。本文我们在大肠杆菌中成功表达了人源锌指蛋白ZNF24全长和其锌指结构域ZNF24(243～368),ZNF24全长蛋白在溶液中以三聚体形式存在，而锌指结构域在溶液中为单体，表明ZNF24蛋白N端的SCAN结构域能够促进全长蛋白的寡聚化。凝胶迁移实验验证ZNF24全长蛋白和锌指结构域与双链DNA底物结合能力，为进一步研究锌指蛋白ZNF24调控基因表达提供理论基础，相关结果表明SCAN结构域介导的蛋白寡聚可能代表了一种新的转录活性调节机制。     

水稻C2H2型锌指蛋白OsZAT12转化拟南芥功能的初步研究

摘要:植物C2H2型锌指蛋白是植物转录调节因子中的大家族,通过转录调控、翻译后调节和蛋白质间的相互作用在植物发育和环境胁迫中发挥关键作用. 本研究在水稻基因组中克隆到一个C2H2型锌指蛋白,命名为OsZAT12. 生物信息学分析显示OsZAT12全长597bp,其中不包含内含子,其蛋白质序列含有199个氨基酸,具有两个典型的C2H2锌指结构. OsZAT12蛋白定位于细胞核,在根中特异性表达.过表达拟南芥植株与野生型比较,其根变短,子叶的变绿率明显降低,植株矮小.初步推断OsZAT12可能影响植物生长发育尤其是根的伸长.     

莲雾果实C4H基因的克隆及在NO处理下的表达分析

以莲雾(Syzygium samarangense)果实RNA为模板,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术对莲雾果实肉桂酸-4-羟基化酶(cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H)基因进行克隆及生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR技术对采后莲雾果实C4H基因在一氧化氮(nitric oxide,NO)处理下的表达水平进行分析。结果表明:莲雾果实C4H基因长1 849 bp,包含长为1 518 bp的开放阅读框,编码505个氨基酸;预测的C4H蛋白质等电点为9. 34,包括一个细胞色素P450和一个反式肉桂酸4-单加氧酶保守结构域,没有信号肽和跨膜结构域。莲雾果实贮藏期间,C4H基因的表达水平和木质素含量逐渐上升,且两者的相关系数达0. 972,呈极显著的正相关。外源NO处理抑制了莲雾果实C4H表达水平和木质素的积累。     

一个拟南芥C2H2锌指蛋白的结构域分析

At3g23140是拟南芥中仅含有一个C2H2锌指结构的转录因子,主要含有N端的C2H2锌指结构和C端的类似EAR两个结构域.将〖WTBX〗〖STBX〗At3g23140〖WTBZ〗〖STB3〗中仅含C2H2锌指结构区域不同长度的两个基因片段〖WTBX〗〖STBX〗A1〖WTBZ〗〖STB3〗(240 bp),〖WTBX〗〖STBX〗A2〖STB3〗〖WTBZ〗(410 bp)克隆到植物表达载体pMON530 35S启动子的下游,并转化野生型拟南芥.经过筛选得到稳定遗传的T3代纯合转化子.对转基因植株研究表明, 35S::〖WTBX〗〖STBX〗A2〖STB3〗〖WTBZ〗转基因植株的内源乙烯释放量明显低于野生型,这与〖WTBX〗〖STBX〗At3g23140〖STB3〗〖WTBZ〗插入失活突变体〖WTBX〗〖STBX〗cs16966〖STB3〗〖WTBZ〗的表型是一致的,而35S::〖WTBX〗〖STBX〗A1〖WTBZ〗〖STB3〗转基因植株的内源乙烯释放量与野生型没有明显区别.表明A2片段的过量表达产生了显性抑制的作用,这种显性抑制效应很可能是由于 A2蛋白片段与〖WTBX〗〖STBX〗At3g23140〖STB3〗〖WTBZ〗表达产物所调控的核酸序列竞争结合所导致.而A2片段C端所含有的非锌指结构域是At3g23140蛋白与靶基因序列结合所必需的.     

拟南芥 BAH1 与大肠杆菌热胁迫耐受的关系分析

拟南芥BAH1含有保守的C3H4型RING结构域,与DnaJ锌指结构类似.利用原核表达纯化的BAH1进行体外泛素化实验证明了BAH1具有E3连接酶活性.然后通过表型回复实验发现BAH1融合J-domain结构域后(JdBAH1)和DnaJ一样能明显弥补danJ突变株MF634的热敏表型,在43℃存活;而转入突变锌指结构的JdBAH1C231S,C234S,C276S,C279S(JdBAH1△Zn1/2)菌株在43℃高温条件下不能存活,说明BAH1在大肠杆菌内具有类似DnaJ锌指结构的功能.因此,BAH1在E.coli中的功能有可能与DnaJ相似,通过锌指结构参与了DnaK/DnaJ伴侣系统发挥功能.     

紫心甘薯转录因子bHLH的基因克隆及功能研究

通过对紫心甘薯中bHLH类转录因子的基因进行分子克隆，对其结构、表达模式及功能进行研究，明确了其结构特征和生物学功能.通过采用RACE克隆方法，获得了编码bHLH基因且长度分别为2 516 bp和2 304 bp的cDNA全序列.基于DNA序列的分子进化树分析结果表明:两者分别属于植物bHLH1和bHLH2基因家族的成员，分别将其命名为IbbHLH1(GenBank登录号:KC708871)和IbbHLH2 (GenBank登录号:JF508437);IbbHLH1和IbbHLH2蛋白均定位于细胞核; 在3个甘薯品种(系)的块根中，IbbHLH2基因与花色素苷合成途径中的酶基因(CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和3GT)的表达量变化趋势相一致，初步推测转录因子IbbHLH2可能参与了紫心甘薯花色素苷合成途径一系列酶基因的表达与调控.     

大鼠小脑特异基因Zic的克隆、序列分析和初步表达

EST（AW055732）片段是SD大鼠脑内一特异表达基因cDNA的3‘-端片段,与小鼠和人的Zic基因同源。基于小鼠及人的Zic基因的同源序列,设计引物用PCR方法从SD大鼠中克隆得到该基因的编码区序列（rZic)。该基因编码一锌指蛋白,其锌指结构域与线虫的tra-1基因,果蝇的ci^D基因。人的Gli癌基因和果蝇的opa基因的锌指结构域高度同源,用RT－PCR方法分析了rZic基因在大鼠脑区分布状况。结果表明,rZic基因在小脑中高表达。将该rZic基因克隆至带有6个组氨酸的表达载体pET-32a( )中,用IPTG诱导rZic融合蛋白在大肠杆菌BL21菌株中表达,诱导后重组蛋白质占菌体总蛋白的20．8％。     

木榄细胞膜Na~+/H~+逆向运输蛋白BgSOS1功能的初步验证

根据木榄BgSOS1的序列信息从木榄中克隆到了全长的BgSOS1基因,该片段包含1个3 462 bp的开放阅读框,可编码1 153个氨基酸的多肽.生物信息学的分析结果表明:该氨基酸序列所编码的蛋白与拟南芥、番茄、水稻、小麦、盐芥和杨树的SOS1蛋白高度同源,同源性分别为63.86%,66.61%,62.18%,60.19%,63.97%和75.97%;BgSOS1蛋白的N端含有12个跨膜的结构域,C端为1个较长的胞内结构域.尽管单个BgSOS1的表达并不能提高转基因酵母的抗盐性,但SOS1,SOS2和SOS3共表达的酵母,其抗盐性明显提高,这表明SOS2/SOS3蛋白激酶复合体可能通过调控BgSOS1的Na+/H+交换功能来提高木榄的抗盐机理.     

‘南林895’杨PdNAC1基因克隆及蛋白的亚细胞定位

以‘南林895’杨(Populus deltoides×P.euramericana cv‘Nanlin895’)为材料,通过RACE-PCR技术,获得了NAC1基因的全长c DNA,命名为Pd NAC1。该序列含有1个长906 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸。该蛋白的分子质量为34.23 ku,等电点为7.44。分析其氨基酸序列发现,该蛋白具有典型NAC转录因子特征,NAM结构域位于11~135个氨基酸之间,含有A、B、C、D、E 5个亚结构域,该区域可以结合DNA;而C端含有一个高度变异的转录激活区。利用杨树原生质体对Pd NAC1蛋白进行细胞亚定位,结果发现Pd NAC1不仅明显定位于细胞核中,而且在细胞膜上也有表达。但Pd NAC1是否具有相应的跨膜结构域尚不明确。     

陆地棉(L.)的克隆及表达载体构建

目的 从棉花抗病品种中克隆WKKY转录因子基因,为棉花抗枯萎病分子育种提供重要的基因资源。方法 以枯萎病菌诱导后棉花基因表达谱中差异表达的WRKY基因片段为探针序列,以陆地棉的抗枯萎病品种'中棉所12'的根部c DNA为模板。运用电子拼接及RT-PCR技术,克隆得到一个新的基因,将该基因命名为(登录号:MH138002)。结果 序列分析发现,基因开放阅读框全长为513bp,编码一个含170个氨基酸残基的蛋白,具有1个WRKY结构域及1个典型的C2H2型锌指结构,属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族。该基因编码蛋白分子量为19.51kd,等电点为9.30,脂肪指数为60.12,属于疏水性蛋白,基因的蛋白二级结构由α螺旋、延伸链和无规则卷曲组成。同源基因进化树分析表明该基因与雷蒙德氏棉亲缘关系最近。结论:从棉花中克隆得到一个新的基因,构建了该基因的植物过表达载体,为进一步研究该基因功能奠定了基础。     

陆地棉(Gossypium hirsutum L.)GhWRKY75的克隆及表达载体构建

目的从棉花抗病品种中克隆WKKY转录因子基因,为棉花抗枯萎病分子育种提供重要的基因资源。方法以枯萎病菌诱导后棉花基因表达谱中差异表达的WRKY基因片段为探针序列,以陆地棉的抗枯萎病品种'中棉所12'的根部c DNA为模板。运用电子拼接及RT-PCR技术,克隆得到一个新的基因,将该基因命名为GhWRKY75(登录号:MH138002)。结果序列分析发现,GhWRKY75基因开放阅读框全长为513bp,编码一个含170个氨基酸残基的蛋白,具有1个WRKY结构域及1个典型的C2H2型锌指结构,属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族。该基因编码蛋白分子量为19.51kd,等电点为9.30,脂肪指数为60.12,属于疏水性蛋白,基因的蛋白二级结构由α螺旋、延伸链和无规则卷曲组成。同源基因进化树分析表明该基因与雷蒙德氏棉亲缘关系最近。结论:从棉花中克隆得到一个新的GhWRKY75基因,构建了该基因的植物过表达载体,为进一步研究该基因功能奠定了基础。     

眼斑拟石首鱼肽聚糖识别蛋白2的基因克隆与组织表达特性

采用同源克隆技术获得了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的肽聚糖识别蛋白2基因(命名为So-pglyrp2).So-pglyrp2的cDNA全长1 729 bp,含有1个1 446 bp的开放阅读框,编码的482 aa前体蛋白带有1个21 aa信号肽;So-pglyrp2基因由4个外显子和3个内含子构成.序列比对分析表明,So-pglyrp2存在1个保守的PGRP结构域,其氨基酸序列与已报道的脊椎动物pglyrp2的同源性最高,一致性为57.1%~82.8%.RT-PCR分析表明,So-pglyrp2基因在肝脏强烈表达,在性腺、肠和胃组织弱表达,在其他组织不表达.研究结果为阐明鱼类pglyrp2基因结构、了解低等脊椎动物pglyrp2的进化地位、探讨鱼类pglyrp2的免疫学功能奠定了坚实的基础.     

猪SOSC1、SOCS3和SOCS4基因克隆及组织表达研究

本文以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆得到长白猪细胞因子抑制因子SOCS-3基因,并首次克隆得到长白猪SOCS-1和SOCS-4基因.此外,还利用长白猪基因组DNA为模板克隆得到SOCS-3假基因(pseudo-SOCS-3).序列分析显示:长白猪SOCS-1基因cDNA编码220个氨基酸的前体蛋白,与人、小鼠、大鼠和牛的氨基酸序列一致性分别为94％、91％、91％和94％;SOCS-3基因cDNA全长690 bp,编码229个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠和小鼠的氨基酸序列一致性高达94％以上;SOCS-4基因cDNA全长1404 bp,整个编码区没有内含子插入,编码441个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠和小鼠的氨基酸序列一致性分别为97％,89％和86％.氨基酸结构分析显示,长白猪SOCS-1,SOCS-3和SOCS-4基因都具有典型的中央SH2结构域和C末端有40个氨基酸的SOCS Box结构域;SOCS-4有长约285个氨基酸的N末端,且没有特殊的结合基序,其长末端存在的生理意义有待进一步研究.采用RT-PCR方法,对长白猪SOCS-1,SOCS-3和SOCS-4基因进行组织表达分析.结果显示它们在所有组织中都有表达.     

日本沼虾表皮几丁质结合蛋白基因的克隆以及KK-42对其表达的影响

为探讨KK-42缩短日本沼虾蜕皮周期的可能机制,首次从日本沼虾步足表皮组织克隆了编码几丁质结合蛋白的一个新基因——MnCBP-1部分cDNA序列,对其序列进行生物信息学分析,qRT-PCR技术检测MnCBP-1基因的表达水平以及KK-42的影响.结果表明,MnCBP-1基因部分cDNA序列为1396bp,含有特征性的几丁质结合结构域(chitin-bind-4),经BLAST比对,MnCBP-1与蚤状溞相似性为44%.qRT-PCR结果显示,步足表皮组织内MnCBP-1基因表达量随着蜕皮前期(D0-2)的开始逐渐增多.KK-42处理后,蜕皮间期(C)幼虾内MnCBP-1基因表达水平分别在6、12、24和48h比对照组显著升高,而在D0-2期和D3-4期MnCBP-1基因转录物仅在个别时间点有所增多.研究表明,MnCBP-1基因表达与蜕皮周期有关,KK-42处理可显著诱导MnCBP-1基因表达,且表达的高峰提前至C期,这可能是KK-42缩短蜕皮周期的机制之一.     

欧美杨PdMODD基因克隆与表达特性分析

【目的】研究杨树重要胁迫响应新基因,为揭示杨树抗逆分子机制、培育优良抗逆杨树新品种提供理论依据。【方法】基于水稻MODD氨基酸序列,通过BLAST在美洲黑杨基因组中筛选得到3条基因(Podel.08G114100、Podel.10G158900和Podel.17G098500),并以其序列为参考,以‘渤丰3号’杨cDNA为模板克隆得到3条基因(PdMODD1、PdMODD2和PdMODD3)。利用生物信息学分析PdMODD蛋白的结构特征及与其同源蛋白的亲缘关系。通过基因枪轰击法分析PdMODD基因亚细胞定位。采用实时荧光定量(qRT-PCR)技术,分析PdMODD基因组织特异性和不同胁迫条件下的的表达模式。【结果】PdMODD1~3基因的开放阅读框(ORF)全长分别为1 065、1 065和1 074 bp,编码354、354和357个氨基酸,均为不稳定的亲水性蛋白。PdMODD基因均为NINJA家族成员,含有3个保守结构域,其中一个为转录抑制基序EAR。系统进化树分析显示,PdMODD1蛋白与毛果杨PtAFP2亲缘性较高并与拟南芥AtAFP1和木薯MeAFP2位于同一个分支;PdMODD2蛋白与麻疯树JcAFP2亲缘关系最近,并与拟南芥AtAFP2聚成一个分支;PdMODD3与毛果杨PtAFP3-1亲缘关系最近,与栓皮槠QsAFP3、拟南芥AtAFP4属于同一分支。亚细胞定位结果表明PdMODD基因均定位于细胞核。组织特异性分析显示,PdMODD1~3在根、茎、叶中均能表达,且在叶中表达量最高,根中表达量最低。胁迫响应表达模式结果显示,NaCl和聚乙二醇(PEG)胁迫处理下,PdMODD1~3在根、茎、叶组织中主要为显著上调表达。【结论】PdMODD1~3均为NINJA家族成员,含有保守的转录抑制基序EAR,具有组织特异性,在叶中高表达,且能被NaCl和PEG胁迫显著诱导表达,推测PdMODD1、PdMODD2 和PdMODD3可能会在‘渤丰3号’杨对盐和干旱胁迫响应中发挥重要的调节作用。     

一个新C2H2型锌指蛋白的功能的初步研究

通过筛选人18周胎脑cDNA文库,得到一条编码332AA的全长新基因,生物信息学研究表明,该蛋白质序列有2个C2H2型锌指结构,其中1个锌指结构有RNA－binding蛋白特异锌指的特征,虽然同源比较发现与多种蛋白质精氨酸N端转甲基酶（protein arginine N-methyltransferase) 有一定的同源性,但新锌指蛋白不含转甲基酶的活性功能区域,属功能未知的基因,利用芯片研究功能未知基因的表达是一种较好的手段,通过代谢增强剂PMA（phorbol myristae acetate)刺激培养的血管内皮细胞,观察细胞受激活后新锌指蛋白基因的表达变化,结果表明新基因表达量提高了11倍以上,证实新基因属内皮细胞的极早期应答基因（Immediate early response gene,ERG)。