杨树MAGPIE和JACKDAW基因克隆、表达及蛋白互作研究

利用RACE技术从杨树不定根中克隆获得PeMGP和PeJDK基因全长cDNA序列,分别包含1 434 bp和1 518 bp长度的开放阅读框。两者都含2个内含子,其氨基酸序列均有4个保守结构域:2个C2H2型锌指结构域ZF1(CX2-4CX3FX4LX2HX3-5H)和ZF2(CX4CXnHXnX4H),2个C2HC型锌指结构域ZF3(CX2CXnHX3C)和ZF4(CXCXnHX3C)。在根茎叶中均检测到PeMGP和PeJKD基因的表达,但它们在杨树不定根发育过程中具有动态的表达模式。杨树原生质体瞬时表达揭示,PeMGP和PeJDK蛋白都定位于细胞核,两者在细胞核发生相互作用。     

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

豌豆胰岛素基因克隆、表达及融合蛋白纯化

将人工合成的豌豆胰岛素(PAlb)基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到PA1b基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2x中,然后将重组质粒pMA1-p2X-PA1b转化大肠杆菌DH5a,经IPTG诱导进行可溶性表达．以Amylose Resin亲和层析,纯化出融合蛋白MBP-PA1b．经SDS-PAGE及Western印迹证明,融合蛋白MBP-PA1b在大肠杆菌中表达成功,为深入研究PA1b的功能作了准备．     

果蝇微管互作蛋白的大规模筛选研究

微管是一种具有极性的、管状的细胞内动态结构,是细胞骨架的重要组分.一些跟微管相关的基因发生突变时,有可能致使严重的人类疾病的发生.这些相关基因编码的蛋白即为微管互作蛋白.影响微管的基因众多,目前发现的影响微管正常组装的蛋白还只是冰山一角,仍有诸多影响微管的互作蛋白等待人类“挖掘”.我们利用已有的果蝇RNAi文库,通过UAS/Gal4系统,对部分基因进行敲减(RNAi),使基因在果蝇幼虫肌肉中特异性沉默,经过免疫染色后观察这些基因功能敲降果蝇的肌肉微管形态,以此来筛选微管互作蛋白.我们共鉴定了541个基因,筛选出微管有表型的40个.其中一些基因在线粒体、内质网、高尔基体、过氧化物酶体等细胞器中具有特定的功能.因此,我们的筛选工作不仅为构建微管相关疾病模型提供了铺垫,为微管相关疾病治疗工作提供了一定的帮助;而且对细胞结构中微管的非中心体微管组织中心探究提供了思路.     

微管结合蛋白tau互作蛋白的筛选

Tau作为微管相关蛋白,对微管的稳定具有重要作用。为了在体内找到与tau互作的基因,我们以具有粗糙眼的tau高表达果蝇为模型,进行遗传学筛选。以具有粗糙眼的tau高表达果蝇为背景,采用RNA干扰手段来下调前期肌肉系统筛选出具有微管异常表型的基因,观察粗糙眼的变化,从而找出与tau互作的候选基因。发现雌雄果蝇有粗糙眼表型的有11株。为了研究粗糙眼表型是否对发育造成影响,通过免疫染色观察眼睛的成虫盘凋亡。发现在11株粗糙眼表型中有5株凋亡细胞数量增加,1株凋亡细胞数量减少,其他无变化。同时,我们对粗糙眼增强的基因型进行睡眠监测,发现有一株RNAi对于光线改变不敏感。因此,我们猜测该基因可能与tau有互作,这对我们找出新的微管调控因子提供了依据。     

水稻MRG701互作蛋白的筛选和鉴定

水稻MRG蛋白MRG702作为组蛋白H3K4/H3K36甲基化的识别蛋白,影响了水稻油菜素内酯BR通路和开花过程中特异的基因表达.MRG蛋白家族的另外一个成员MRG701在序列上与MRG702高度同源,它们的共同缺失突变体表现出矮小、直立、晚花等多种表型.以MRG701为饵,筛选了水稻全长均一化酵母文库,得到了26个可能与MRG701结合的蛋白质,通过定位分析,这些蛋白主要定位于细胞核和线粒体中,在二者中的分布比例分别为46.2%和23.1%.通过酵母双杂交实验和双分子免疫荧光实验,对全部得到的26个蛋白和其中4个蛋白与MRG701蛋白的相互作用进行了验证,发现Os10g0410600,Os05g0215800,Os04g0687100和MRG701在烟草中存在相互作用,为进一步研究甲基化识别蛋白的作用机制及作用网络提供了基础.     

天花粉蛋白基因克隆、序列分析及在E.Coli中表达

天花粉蛋白为单链核糖体失活蛋白,具糖苷酶活性,对 HIV 和多种动植物病毒有明显的抑制作用,有广泛的理论价值和应用前景.本文在国内首次采用聚合酶链式反应(PCR)方法,以栝楼染色体 DNA 为模板、合成的寡聚核苷酸为引物,扩增出了编码成熟天花粉蛋白的 DNA 片段(称 gene 1)和编码含23个氨基酸组成的分泌型信号肽、成熟天花粉蛋白以及羧基端延伸因子在内的 DNA 片段(称 gene 2).两 DNA 片段已被组装于载体     

结合多组学和人类蛋白互作网络研究急性髓细胞白血病中的突变基因互作子网络

急性髓细胞白血病(AML)是一类由血液中白细胞恶性增殖引起的恶性疾病,很多与AML致病性相关的基因突变还没有被阐明,使用基于多组学整合分析的方法可以有效地揭示AML中基因突变与疾病间的相互关系.通过使用来源于癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)计划中AML病人的1 450个体细胞突变基因数据和这些基因的RNA表达量数据,结合人类蛋白互作网络,构建了在AML中的基因子网络.发现的基因子网络中包含21个突变基因,KEGG代谢通路和GO富集分析结果表明,趋化因子信号通路和染色体结构相关基因在AML的致病性中具有重要作用;并且,基因子网络可以反映AML中突变基因间的相互作用关系,可以加强对AML致病机理认识.在基因子网络中,部分基因已经被证明与AML相关,如NPM1,KDM1A和NRAS等,但部分基因还需要进一步探索,如CBX7,GNAI2和COPS2等.对这些基因的深入研究可以加强对疾病致病机理的认识.最后提供了整合多组学数据研究疾病的框架,并且该框架可以应用于其他疾病或机制的研究中.     

抗、感病杨树与溃疡病菌互作中活性氧及相关酶的动态

测定了接种溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)后两种抗性水平不同的杨树(Populus spp.)树皮中超氧阴离子(O2.-)、过氧化氢(H2O2)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)及膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量的动态变化,分析了杨树与溃疡病菌互作中活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的产生、抗氧化酶活性及膜脂过氧化水平的变化规律及与杨树抗病性的关系。结果表明,随接种时间的延长,两种杨树O2.-产生速率和H2O2含量均有上升趋势,抗病杨树毛白杨(P. tomentosa Carr.)出现了较明显的"氧化爆发",感病杨树北京杨(P. beijingensis Hsu)则不明显;POD活性持续上升,毛白杨的上升幅度大于北京杨的;SOD、CAT活性先上升后下降,北京杨两种酶活性在后期受到的抑制更明显;APX活性则在两种杨树中变化较大,毛白杨的变幅明显比北京杨的大;MDA含量增加,表明"氧化爆发"启动了膜脂过氧化,北京杨在接种后期MDA含量大幅上升,并且MDA含量与O2.-产生速率呈显著正相关。     

刚毛柽柳Th2CysPrx基因的互作蛋白及其表达模式分析

【目的】使用酵母双杂交系统研究刚毛柽柳中获得的2CysPrx(硫氧还蛋白过氧化物酶)基因(命名为Th2CysPrx)及编码蛋白的功能。【方法】通过酵母双杂交系统对该基因编码蛋白的互作蛋白进行筛选,进一步利用qRT-PCR 技术分析NaCl 和PEG₆₀₀₀ 胁迫下刚毛柽柳叶组织和根部组织中Th2CysPrx 基因与其互作蛋白基因的表达模式。【结果】酵母双杂交系统筛选获得了4 个可能与Th2CysPrx 互作的蛋白,分别为丙氨酸-乙醛酸转氨酶2(alanine-glyoxylate aminotransferase 2,ThAGT2)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,ThMDH)、黄酮醇合酶(flavonol synthase,ThFLS)和扩展蛋白(expansin,ThEXP)。基因表达分析结果显示:盐胁迫下,柽柳叶和根中,Th2CysPrx和ThAGT2 基因的表达模式基本一致; 而干旱胁迫下,Th2CysPrx和ThAGT2 基因在叶和根中具有相同的表达模式。【结论】在盐和干旱胁迫下,ThAGT2 基因与Th2CysPrx 表达模式均趋于一致,表明Th2CysPrx 基因均可能通过与ThAGT2 基因的互作共同参与抗逆过程,为进一步研究Th2CysPrx 基因的抗逆机制,以及与其他抗逆基因的关系提供了依据。     

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.     

猪SOSC1、SOCS3和SOCS4基因克隆及组织表达研究

本文以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆得到长白猪细胞因子抑制因子SOCS-3基因,并首次克隆得到长白猪SOCS-1和SOCS-4基因.此外,还利用长白猪基因组DNA为模板克隆得到SOCS-3假基因(pseudo-SOCS-3).序列分析显示:长白猪SOCS-1基因cDNA编码220个氨基酸的前体蛋白,与人、小鼠、大鼠和牛的氨基酸序列一致性分别为94％、91％、91％和94％;SOCS-3基因cDNA全长690 bp,编码229个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠和小鼠的氨基酸序列一致性高达94％以上;SOCS-4基因cDNA全长1404 bp,整个编码区没有内含子插入,编码441个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠和小鼠的氨基酸序列一致性分别为97％,89％和86％.氨基酸结构分析显示,长白猪SOCS-1,SOCS-3和SOCS-4基因都具有典型的中央SH2结构域和C末端有40个氨基酸的SOCS Box结构域;SOCS-4有长约285个氨基酸的N末端,且没有特殊的结合基序,其长末端存在的生理意义有待进一步研究.采用RT-PCR方法,对长白猪SOCS-1,SOCS-3和SOCS-4基因进行组织表达分析.结果显示它们在所有组织中都有表达.     

猪STAT4、STAT6基因克隆及组织表达研究

本研究以长白猪为材料,克隆了STAT4和STAT6基因的cDNA全长,其中STAT4基因cDNA全长2269 bp,编码748个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物STAT4氨基酸序列一致性分别为97%、98%、96%、96%;STAT6基因cDNA全长2637 bp,编码847个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物的氨基酸序列有很高的同源性,分别为93%、95%、88%和87%.采用RT-PCR方法,本研究对家猪STAT4和STAT6基因进行组织表达分析.结果显示:STAT4在所有组织中都有表达,STAT6在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、小肠等组织中有表达.此外,本研究已将家猪STAT4和STAT6基因编码区序列克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中,并做了初步功能鉴定.     

喷雾冷冻干燥对卵白蛋白和卵黏蛋白互作的影响

为了探究喷雾冷冻干燥(SFD)对卵白蛋白(OVA)和卵黏蛋白(OVM)互作结构及功能特性的影响,以喷雾干燥(SD)和真空冷冻干燥(FD)为对照,通过低场核磁共振、傅里叶红外光谱、荧光光谱、差式扫描量热、扫描电镜等方法进行分析.分析结果表明:SFD互作蛋白自由水减少,结合水增加,保水性增强.SFD互作蛋白的α-螺旋和β-折叠结构比例大,蛋白聚集程度小.在波长340 nm处荧光峰强度为SFD>FD>SD.SFD互作蛋白的变性温度比SD蛋白低了51.37℃,接近FD蛋白.SFD互作蛋白表面是球状结构,内部空间是网络结构.SFD互作蛋白的乳化性、溶解性、起泡性和泡沫稳定性与FD蛋白接近,均显著优于SD蛋白(P<0.05).SD蛋白比SFD蛋白的表观黏度大;储能模量均高于损耗模量.同时考虑到FD成本较高,认为SFD更适合加工生产.     

凋亡素融合蛋白的基因克隆、表达与体外活性分析

来源于HIV-1病毒(47~57位氨基酸)的TAT小肽具有跨膜功能,可以将外源蛋白进行跨膜转运。通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了TAT-凋亡蛋白序列,与载体pET-28b连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高表达,以包涵体形式表达的TAT-凋亡蛋白在变性条件下进行了Ni-NTA纯化,纯化的蛋白经MTT法证明具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

大肠杆菌RsmH基因克隆及表达

以大肠杆菌全基因组DNA为模版,PCR扩增目的基因rsmh,构建pMD18-T-RsmH重组克隆载体和pET-28aRsmH重组表达载体,转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达RsmH蛋白,利用重组His-tag,通过Ni-NTA亲和层析对RsmH蛋白进行纯化。SDS-PAGE对RsmH蛋白进行定性分析,考马斯亮蓝法测定RsmH蛋白含量,确认获得质量浓度为3.91 g/L纯化的rsmh表达蛋白。     

杨树锈病抗性遗传特性及基因克隆策略研究进展

杨树全基因组测序工作显示,抗病基因往往呈簇状分布,采用合理的策略克隆出物理上独立的抗病基因,可为抗病育种工作提供捷径。笔者从杨树锈病病原菌生物学特性、寄主对锈菌的抗性、抗锈病基因克隆等几个方面分析了近年来关于杨树抗性遗传位点的确定,抗性基因克隆策略的发展及可能的应用,并对杨树抗病育种工作进行了展望。     

中华绒螯蟹免疫蛋白互作网络提取及分析

为了研究中华绒螯蟹的免疫蛋白作用机制,在已构建的中华绒螯蟹蛋白互作网络基础上,采用邻接节点注释方法对其全局网络进行细胞组分注释,为网络的903个未定位蛋白中的830个添加了GO注释,占未定位蛋白的91.9%.从中华绒螯蟹蛋白互作网络中提取了包含142个蛋白和158条蛋白互作关系的免疫互作网络,并且结合GO细胞组分注释信息,得到了其中62个免疫蛋白的细胞组分定位.通过对细胞定位的分析发现,中华绒螯蟹的免疫蛋白多位于膜结构、细胞核和细胞骨架中.     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(I)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法,用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A.从该蛋白编码序列中设计引物,以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段.将所得片段与pMD l8-T载体连接,转化到JM l09大肠杆菌中,从转化平板上挑出菌落,用碱裂解法提取质粒,通过PCR和酶切分析,筛选到阳性克隆,测序结果与文献报道结果一致.提取质粒,用BamHI和XhoI酶切,回收目的片段,分别克隆到原核表达载体pET28a( )和pGEX-6P-1中,转化JM l09受体菌,从JM l09受体菌中提出质粒,再转化到BL21(DE3)菌中,筛选出阳性克隆,构建了人扭转蛋白A原核表达载体.IPTG诱导该工程菌,培养并离心收集.SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达.