巴西橡胶树HbNAM基因克隆和表达分析

为了研究巴西橡胶树中植物特有NAC转录因子的功能,笔者通过RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对HbNAM的开放阅读框(ORF)进行了克隆和表达分析,并通过酵母转化实验进行转录激活活性分析。结果显示,HbNAM基因ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,在第12—167位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,属于NAC转录因子家族中的NAM亚族。酵母试验表明,HbNAM在高度变异C端具有转录激活活性,具备转录因子的基本特征。实时荧光定量PCR分析发现,HbNAM在叶片、雄花、雌花、胶乳和树皮中均表达,其中以光合组织叶片和生殖组织雄花中的表达量最高,并且胶乳中该基因的表达受割胶、植物激素或植物生长调节剂茉莉酸(JA)和乙烯利(ET)以及低温胁迫影响,推测HbNAM可能与植物的生长发育和胁迫应答过程有关。     

甘蔗果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

以高等植物玉米、水稻的果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶(F2KP)的保守区域设计引物,并采用逆转录--聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从甘蔗叶片中扩增F2KP的cDNA片段,命名为SoF2KP-L.该cDNA片段长2 178 bp,含2 085 bp的完整开放阅读框,编码 694个氨基酸.序列分析表明,甘蔗F2KP与其它已知的高等植物F2KP具有很高的同源性.     

橡胶树胶乳C-乳清死皮相关蛋白的鉴定及分析

橡胶树死皮是影响天然橡胶产量的重要限制因子。通过双向凝胶电泳技术(2-DE)研究了橡胶死皮树与健康树胶乳C-乳清蛋白表达谱的差异。以软件分析后共获得31个差异表达的蛋白点,经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析后,搜索NCBInr数据库,结果有10个蛋白点被成功鉴定,其中6个为未知蛋白,其余4个蛋白分别为chain A,struc-ture of ubiquitin-like protein,Rub1;β-1,3-glucanase;AIR9 protein和flagellar inner dynein arm heav-y chain 11。这些蛋白可能在橡胶树死皮发生过程中扮演重要角色。     

拟松材线虫两个HSP基因的克隆与分析

采用RACE(快速扩增cDNA末端)技术从拟松材线虫中克隆了HSP70蛋白编码基因mc2和HSP90蛋白编码基因mc19,两个基因的全长cDNA分别为2 067和1 222 bp。生物信息学分析结果表明：mc2基因的ORF为1 926 bp,推测的编码蛋白包含642个氨基酸,分子质量为170.85 ku,等电点为4.69。mc19基因的ORF为1 083 bp,推测的编码蛋白包含361个氨基酸,分子质量为97.70 ku,等电点为4.83。多序列比对和系统进化树结果分析都表明,拟松材线虫的mc2、mc19基因的编码蛋白与植物寄生线虫HSP70和HSP90蛋白具有较高的同源性,拟松材线虫和松材线虫之间的亲缘关系尤其密切。     

毛竹PeSCL6基因的克隆及其表达分析

SCL6基因是植物保持茎端分生组织未分生状态所必需的关键基因之一。采用RT-PCR和RACE方法从毛竹(Phyllostachys edulis Carr.)中获得一个SCL6同源基因,命名为PeSCL6。该基因全长1 894 bp,其中5'端非编码区60 bp,3'端非编码区211 bp,编码区1 623 bp,共编码540个氨基酸。序列分析表明:PeSCL6基因编码的蛋白含有LHRI、VHIID、LHRII、PFYRE和SAW 5个保守区,属于GRAS家族蛋白; 该蛋白与水稻、玉米、高粱等单子叶植物的SCL6有较高的一致性(70%以上)。实时定量PCR结果表明:PeSCL6基因为组成型表达,且在叶片中的表达丰度最高; 而在即将开花之前和处于盛花期的竹株叶片中PeSCL6表达丰度明显降低,分别为幼龄竹株叶片的1%和14%。PeSCL6基因表达的变化,意味着它可能参与毛竹由营养生长向生殖生长的转换调控。     

大熊猫核糖体蛋白RPL5基因的克隆、表达与比较分析

为了解大熊猫(Ailurophilic melanosome)核糖体蛋白亚基RPL5基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPL5基因的异同,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中和DNA中分别对核糖体蛋白亚基RPL5基因的表达序列和其结构基因进行了克隆、测序;采用ORF finder软件对表达序列的开放阅读框(ORF)进行了查找和氨基酸序列的推定;采用Gen scan对结构基因进行了分析;采用DNAMAN Version 6对基因序列和氨基酸序列进行了同源性比较;采用ExPASy软件进行蛋白质功能位点和生化特性进行了预测分析;对大熊猫核糖体蛋白亚基RPL5基因进行了超表达实验.结果表明:大熊猫RPL5结构基因长为8 633bp,具有8个外显子和7个内含子;mRNA长为918bp,ORF为894bp,编码295个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为34 402.6,等电点为9.73,含有1个依赖于AMP和GMP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,8个十四(烷)酰化位点.分析表明,大熊猫RPL5基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物包括人(Homo sapiens)、牛(Bos Taurus)、猪(Sus scrofula)、小家鼠(Mus altocumulus)和褐家鼠(Rat-hauser nonstrategic)具有很高的相似性,大熊猫RPL5核苷酸序列与这些物种的相似性分别为94.52%、92.51%、91.95%、91.05%和89.15%,而氨基酸序列相似性分别为99.33%、98.65%、98.65%、98.32%和98.65%.超表达实验结果显示:大熊猫RPL5基因能在大肠杆菌BL21中有效表达,且在2h时达到表达高峰.运用分子生物学原理与相应的技术手段,成功地扩增出大熊猫RPL5基因的表达序列,并对其编码的蛋白进行了初步分析,丰富和完善了哺乳动物RPL5基因资料库,同时也为深入研究大熊猫RPL5基因的功能提供了相关基础数据.     

中华绒螯蟹内源性白斑综合症病毒基因EjsWSSV的克隆与鉴定(英文)

基于已获得的表达序列标签序列,应用RACE技术从中华绒螯蟹基因组中获得了一个白斑综合症病毒基因(EjsWSSV)的全长cDNA序列,全长为3 864 bp并包含一个3 732 bp的开放阅读框,编码一个138.25 kDa的含1 243个氨基酸的多肽,编码的氨基酸序列包含一个VWA结构域.通过序列比对、序列结构比较和一些生物信息学预测分析,表明EjsWSSV蛋白序列与白斑综合症病毒基因组的ORF16具有高同源性,它不含有信号肽和跨膜区,为非分泌型和α-螺旋型蛋白,可能定位于细胞质.通过PCR检测验证,EjsWSSV基因可能为内源性病毒基因.     

皱纹盘鲍亮氨酸氨肽酶基因cDNA克隆及表达分析

利用PCR和RACE技术从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肌肉中克隆亮氨酸氨肽酶基因cDNA序列,并对其结构进行分析。皱纹盘鲍亮氨酸氨肽酶(Haliotis discus hannai leucine aminopeptidase,Hdh-LAP)cDNA全长共3251 bp,包含5'非编码区(5'UTR)56 bp,3'非编码区(3'UTR)651 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)2544 bp,共编码847个氨基酸残基。多序列比对结果显示,该氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、霸王莲花青螺(Lottia gigantea)、囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)的亮氨酸氨肽酶序列相似性分别为85%、68%和61%。预测Hdh-LAP基因编码蛋白质的相对分子质量为95.09 ku,理论等电点为5.16。Hdh-LAP蛋白质的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,其中α-螺旋占38.02%,无规则卷曲占30.11%,β-折叠占22.43%,β-转角占9.45%。Hdh-LAP主要分布在细胞质(59.2%)、线粒体(10.0%)和溶酶体(10%)中,推测其可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。系统发育关系分析结果显示,Hdh-LAP与牡蛎亮氨酸氨肽酶关系最近。荧光定量PCR结果表明,Hdh-LAP基因在鲍肌肉、肝胰腺、性腺、血淋巴细胞、腮、外套膜等6个组织中均有表达,在血淋巴细胞中表达量最高,肌肉次之,性腺最少。     

柑橘溃疡病相关基因CitEX3的克隆与表达分析

利用RT-PCR和PCR扩增技术,获得纽荷尔脐橙富亮氨酸重复序列受体样蛋白激酶EXS(EXTRA SPOROGENOUS CELLS)基因CDs全长,命名为Cit EX3.生物信息学分析表明,该基因CDs全长2 667bp,编码888个氨基酸,最大开放阅读框2 667bp,属于富亮氨酸重复序列蛋白激酶家族(LRR-RLKs).Cit EX3基因所编码蛋白EXS3分为胞外域、跨膜域和胞内激酶结构域,胞外域中存在保守的LRR重复序列,胞内激酶结构域中存在一个保守的丝/苏氨酸催化域重复序列.Southern Blot分析表明,在纽荷尔、椪柑、四季桔和金柑中该基因都以单拷贝形式存在.实时荧光定量PCR分析表明,接种溃疡病病菌后,该基因受溃疡病诱导上调表达,推测该基因可能与柑橘溃疡病抗性相关.     

孝顺竹笋箨全长转录组测序分析

【目的】揭示竹子笋箨的生物学功能与其衰老的分子基础。【方法】利用PacBio Sequel 3代全长转录组测序技术结合生物信息学方法,对孝顺竹不同衰老阶段笋箨全长转录本进行分析。【结果】共获得106 148 条平均长度为3 615 bp的全长转录本。多数转录本长度分布在1.4~7.0 kb。NCBI等注释显示,97.34%的转录本具有注释结果。Mercator注释分析显示笋箨转录本覆盖了其全部34 个类别,其中与蛋白类别相关的序列最多,达到了18 224 条;与microRNA类别相关的最少,仅有9 条。在重要功能基因方面,共获得了2 489 条激素代谢及信号转导相关序列; 8 804 条转录因子序列中393 条与光合作用相关的转录本。其中,注释到的189 条共30 类NAC(NAM/ATAF/CUC)转录因子基因,93.33%的NAC基因,共计28类,其表达量与笋箨衰老呈相关性, 包括已被证实在叶片衰老中具有重要调控作用的NAC002、NAC016、NAC017、NAC029(NAP)、NAC042、NAC055与NAC083等7个NAC转录因子与NAC014等14个被报道在叶片衰老中具有潜在作用的NAC基因。NAC025、NAC028、NAC045、NAC061、NAC086、NAC103与NAC1L (NAC 1 Like) 7 个NAC转录因子表达与孝顺竹笋箨衰老呈正相关,为新发现的正调控笋箨衰老的潜在转录因子。此外,利用MISA程序在76 499 个序列中检测到简单序列重复(simple sequence repeats,SSR)位点,主要以单核苷酸重复(SSRs)为主,占据了全部(SSRs)的55.2%。利用PLEK等软件共获得2 769个长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。【结论】竹子笋箨基因表达多样化,并具有完整的光合系统基因,显示其具有潜在光合功能;NAC转录因子在孝顺竹笋箨衰老中具有潜在重要调控作用。本研究首次解析了竹子笋箨的全长转录本特征,为今后深入分析竹子笋箨功能及其衰老的分子机制奠定基础。     

橡胶树胶乳橡胶粒子死皮相关蛋白的鉴定及分析

橡胶树死皮是影响天然橡胶产量的重要因子之一。采用双向凝胶电泳对健康树和死皮树橡胶粒子中差异表达的蛋白进行分离,分析获得35个差异表达的蛋白点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析及搜索Uniprot rubber数据库后,有13个蛋白点被成功鉴定,其中橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)、法尼基焦磷酸合成酶(Ffarnesyl-diphosphate synthase,FPS)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GPX)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)、翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)、热激蛋白(heat shock protein, HSP)等主要蛋白参与了橡胶的生物合成、活性氧代谢及细胞凋亡过程。说明橡胶的生物合成、活性氧代谢及细胞凋亡途径可能是橡胶树死皮发生的关键调控途径。     

Characterization of the separate kinase domain of chicken liver 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase

The bifunctional enzvme 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase consists of two dis tinct domains which catalyze the synthesis and hydrolysis of fructose-2, 6-bisphosphate, respectively. In this work the properties of the separate 6-phosphofructo-2-kinase domain were investigated. Purification of the expressed separate do main or isolation of this domain from purified glutathione S-transferase (GST) fusion protein with thrombin cleavage led to the loss of its kinase activity. Thus the domain in the GST-tagged form was characterized. The two forms of the do main with different lengths (amino acids 1 ～ 249 and 1 ～ 286) were very similar in kinetic property and could catalyze the formation of fructose-2,6-bisphosphate with a kcat 4-fold lower than that of the full-length enzyme. In addition, the domain was much more sensitive to guanidine inactivation and heat denaturation, and less stable at pH values below 7 than the full-length enzyme. The results suggest that the separate kinase domain of the bifunctional enzyme is far less perfect in structure in the absence of the bisphosphatase domain, though it still possesses the 6-phosphofructo-2-kinase activity.     

薄荷MhWRKY57基因克隆及响应茉莉酸信号的表达分析

【目的】分析薄荷转录因子MhWRKY57的基因和氨基酸特性、亚细胞定位、转录活性、组织表达及茉莉酸甲酯处理下的基因表达水平,为揭示MhWRKY57响应茉莉酸信号调控薄荷精油合成的分子机制提供理论依据。【方法】 利用薄荷转录组数据,采用RT-PCR方法获得MhWRKY57基因编码序列,利用生物信息学分析其基因和氨基酸特性,烟草叶片瞬时表达系统进行亚细胞定位,酵母双杂交系统分析转录激活活性,实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)技术分析MhWRKY57基因在各组织及茉莉酸甲酯诱导下的表达模式。【结果】 获得薄荷MhWRKY57基因的编码序列(CDS),编码276个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,含34个磷酸化位点,属于非跨膜亲水蛋白,定位于细胞核且具有转录激活活性。系统进化分析表明,薄荷MhWRKY57与大豆Glyma.01G056800.2.p亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明,MhWRKY57基因在幼叶、成熟叶、花、茎、根中均表达,在根和叶中均明显受到茉莉酸甲酯诱导表达。【结论】 MhWRKY57是一个响应茉莉酸信号的转录因子,可能参与茉莉酸信号介导调控的薄荷精油合成过程。     

刚毛柽柳ThPCS 1基因克隆与镉胁迫应答分析

[目的]探究刚毛柽柳(Tamarix hispida)植物络合素合酶(phytochelatin synthase,PCS)基因ThPCS1的镉胁迫应答功能.[方法]通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对刚毛柽柳ThPCS1基因进行克隆;通过BioEdit、MEGA 5.0等软件对ThPCS1蛋白进行生物信息学分析...     

杨树GABA支路3个基因家族的鉴定和表达分析

【目的】 γ-氨基丁酸(GABA)与植物的生长发育有着密切的联系。结合前期对GABA抑制杨树不定根发育的研究,对GABA支路基因家族的特征和表达模式进行研究,为进一步解释其在不定根发育中的作用奠定基础。【方法】从银白杨(Populus alba)×P. glandulosa ‘84K’(‘84K’杨)基因组中鉴定出GABA支路的PopGAD、PopGABA-T和PopSSADH 3个基因家族成员,并利用生物信息学方法分析其特征,以及与其他物种相关基因家族的亲缘关系;利用qRT-PCR研究外源GABA及其降解抑制剂vigabatrin(VGB)对各基因表达的影响。【结果】①PopGAD、PopGABA-T和PopSSADH 3个基因家族成员数量依次为6、2和2个,启动子序列中主要包含与光、激素和环境等响应相关元件。②系统进化分析表明,PopGAD家族中PopGAD6与家族其他成员亲缘关系较远;PopGABA-T和PopSSADH家族中的两个基因成员亲缘关系较近。③基因表达分析表明,不定根生长过程中GABA支路基因总体上在根中表达量高于茎和叶。外源GABA或VGB处理对PopGAD和PopGABA-T两个基因家族成员在根、茎和叶中的表达量影响程度不同,但对 PopSSADH基因家族的表达则无明显影响。【结论】 GABA支路3个基因家族在‘84K’杨树响应光、激素和环境胁迫等方面具有重要作用。外源GABA和VGB处理对PopGAD和PopGABA-T家族成员的影响较大,并且均在根中表达量最高,表明这两个基因家族在不定根生长过程中发挥着重要调控功能。这为深入解析GABA在树木不定根发生中的作用机制奠定了基础。     

山桐子IpSAD基因家族分析及功能鉴定

【目的】硬脂酰-ACP Δ⁹脱氢酶(stearoyl-ACP Δ⁹ desaturase,SAD)是决定脂肪酸组成的关键酶,分离和鉴定木本油料植物山桐子(Idesia polycarpa)的SAD基因,可为遗传改良山桐子油的脂肪酸组成提供基因资源。【方法】 使用 HMM 和 Blastp 鉴定山桐子全基因组中的SAD家族成员;利用MEGA X、MEME和PlantCare等在线软件对其蛋白质理化性质、系统发育关系、基因结构、保守基序和启动子顺式调控元件等进行分析;使用MCSCANX分析山桐子和毛果杨SAD基因之间的共线性关系;基于RNA-seq数据,分析IpSAD各成员的表达模式,通过病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)快速验证它们的生物学功能。【结果】 ①在山桐子基因组中共鉴定到7个IpSAD基因(IpSAD1~7),多重序列比对结果显示各成员间序列相似度较高且结构域保守;②系统发育分析表明,IpSAD成员可以分为3个亚组,与拟南芥SAD家族的分类结果一致,拟南芥单不饱和油酸合成关键基因AtSSI2与山桐子IpSAD2、IpSAD3、IpSAD4的亲缘关系较近;③启动子区域顺势调控元件预测结果显示IpSAD基因的启动子含有光反应、脱落酸响应等顺式调控元件;④IpSAD基因按其组织表达模式可分为3类,第1类和第2类成员在大部分组织中表达量较低,而第3类成员在所有组织中表达量均较高。⑤沉默IpSAD基因使叶片的油酸含量显著降低,其中IpSAD3的沉默可使油酸含量下降76%。【结论】 明确了IpSAD家族各成员的基本特征,确定了它们对于油酸合成的生物学功能,并为山桐子油脂生物合成调控机制研究奠定了基础。     

青杄PwWrbA基因克隆及表达分析

色氨酸阻遏结合蛋白(tryptophan repressor-binding protein,WrbA)是一种重要的抗氧化酶类,参与了多种逆境反应。笔者通过RACE-PCR的方法克隆得到青杄WrbA基因的cDNA全长,共1 045 bp,编码区651 bp,编码203个氨基酸。利用生物信息学工具对其进行理化性质、二级结构和三级结构的分析,该蛋白理论分子质量21.80 ku,pI值6.43,N端11—15位氨基酸和C端112—165位氨基酸是FMN结合位点。荧光定量PCR和半定量RT-PCR发现青杄PwWrbA在各组织中都有表达,但在针叶中表达量最高。同时,PwWrbA在NaCl和ABA胁迫处理后表达量升高,H₂O₂也会影响其表达的改变,H₂O₂处理6 h后表达量上调。因此,PwWrbA是一个新的WrbA基因,推测其可能在青杄逆境胁迫应答中发挥作用。     

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)多聚半乳糖醛酸酶基因(BpPG),并阐明BpPG基因在B. pyrrocinia JK-SH007定殖中的生物学功能。【方法】通过设计特异性引物(PG-F、PG-F)克隆BpPG基因,并对其全长基因进行生物信息学分析; 采用MEGA 5.0软件进行系统发育树分析; 将B. pyrrocinia JK-SH007接种杨树,利用实时荧光定量PCR方法,分析BpPG基因在B. pyrrocinia JK-SH007定殖过程中的差异表达。【结果】BpPG基因全长2 001 bp,编码666个氨基酸,预测蛋白质分子量69.23 ku,理论等电点为8.37; BpPG蛋白有6个蛋白质结合位点,属于Glycosyl hydrolases family 28家族,为亲水性蛋白,不具有信号肽。二级结构主要包括α-螺旋、β折叠、延伸链和无规则卷曲,三级结构预测结果与二级结构相符。系统进化分析表明,BpPG与PG(GenBank 序列号WP 034181566.1)具有同源性。实时荧光定量PCR结果显示B. pyrrocinia JK-SH007定殖过程中,不同时期的BpPG基因表达量存在差异。【结论】克隆得到BpPG基因,BpPG基因在进化上是保守的,其极有可能在B. pyrrocinia JK-SH007定殖过程中发挥作用。     

杨小舟蛾MtroOBP1基因的克隆、序列分析及表达

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)是一种嗅觉相关的蛋白,该蛋白参与大多数气味分子的识别过程,并与气味分子相结合。获得杨小舟蛾[Micromelalopha troglodyta (Graeser)]OBPs以明确其特性。【方法】选择羽化后健康的杨小舟蛾触角为模板,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆杨小舟蛾MtroOBP1基因,利用生物信息学分析软件研究其基因序列和蛋白结构,运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术研究MtroOBP1的组织表达模式。【结果】利用RT-PCR技术从杨小舟蛾触角总RNA中扩增得到MtroOBP1基因(GenBank登录号:MN056510),序列分析表明,MtroOBP1开放阅读框为777 bp,一共编码了258个氨基酸残基,且翻译的氨基酸序列仅含有4个保守的半胱氨酸位点,表明得到的OBP基因的编码蛋白不属于典型气味结合蛋白家族,而是属于Minus-C家族。蛋白质理化性质预测显示:MtroOBP1蛋白的分子量为29 664.57 u,等电点为6.23,有18个潜在的磷酸化位点,没有明显的跨膜区,疏水指数为-2.011~3.078,有一个由19个氨基酸组成的信号肽,说明为分泌型蛋白。组织表达模式表明MtroOBP1在杨小舟蛾的各部位都表达,但在触角中表达量最高。【结论】首次克隆得到杨小舟蛾MtroOBP1基因,在触角中高表达,推测其蛋白具有运输气味分子的功能,在杨小舟蛾的嗅觉识别中起着至关重要的作用。