低温胁迫下梁山慈竹再生植株叶绿素荧光特性和耐寒转录因子的表达

以生长期一致的梁山慈竹实生苗(SS)和梁山慈竹种子成熟胚离体诱导愈伤组织获得的再生植株(No.101-1c、No.42-1-B、No.90-3)为材料,分析不同低温胁迫下其叶绿素荧光参数和耐寒相关转录因子表达量的变化,研究低温胁迫对梁山慈竹再生植株耐寒性的影响。结果表明:SS可耐受0℃低温处理,No.90-3仅能耐受4℃低温处理,而No.101-1c和No.42-1-B可以耐受-10℃低温处理,表明不同再生植株对低温胁迫的耐受能力不同,且与实生苗也有明显差异。低温胁迫条件下,SS、No.101-1c与No.90-3的Fv/Fm、Y(Ⅱ)和qP值均下降;No.42-1-B的Y(Ⅱ)值先上升后下降,其Fv/Fm、NPQ和qP则随温度降低而下降。实生苗的WRKY与CBF1基因的表达量降低,MYB基因的表达量上升;再生植株No.90-3和No.42-1-B的MYB、WRKY和CBF1基因的表达量均随温度降低而升高;No.101-1c的WRKY和CBF1基因表达量上升,而MYB表达量下降。相关性分析结果表明:实生苗中WRKY和CBF1的表达量与Y(Ⅱ)的值呈显著的正相关关系;No.101-1c中MYB的表达量与Y(Ⅱ)的值呈显著的正相关关系,而WRKY和CBF1的表达量与NPQ的值呈显著的负相关关系;No.42-1-B中WRKY的表达量与qP的值呈显著的负相关关系。     

茭白低温胁迫下内参基因筛选和相关基因表达分析

为探究低温胁迫下茭白的最适内参基因，分别以低温(4℃)胁迫0,3,6,12,24,48,96 h的茭白叶片为材料，通过qRT-PCR技术和geNorm, NormFinder, BestKeeper, ReFinder软件分析8个候选内参基因ACT,H2B,UBQ,GAPDH,β-actin,60s,SKIP,AQP的表达稳定性；并利用筛选出的最适内参基因组合β-actin,H2B和ACT对响应低温胁迫相关基因的表达水平进行分析.结果表明：在低温胁迫中CDPK的表达量在前期上调，随后下调；DREB/CBF的表达量也有上调，但总体呈现波动变化；ICE1和WRKY的表达量先显著上调，在24 h达到较高水平，后期表达量下降.结果显示，这些基因在茭白中可能以不同的方式响应低温胁迫，为后续茭白低温响应分子机制的研究奠定了基础.     

低温胁迫对乐都紫皮大蒜生长及果聚糖代谢关键酶基因的影响

果聚糖的代谢过程不仅影响大蒜的产量和品质,也能有效地提高大蒜植株的抗逆性。为探讨低温胁迫对大蒜生长和果聚糖代谢酶基因表达的影响,本试验以乐都紫皮大蒜为试验材料,在正常培养(25℃)和低温胁迫(4℃)下探究大蒜幼苗处理0、3、6、9和12 d时的生长指标变化特征及蔗糖∶蔗糖1-果糖基转移酶基因(1-SST)与果聚糖外切水解酶基因(1-FEH)的表达特性。结果表明:(1)低温胁迫对乐都紫皮大蒜幼苗生长产生了抑制作用,胁迫3 d时,乐都紫皮大蒜幼苗的株高、最大叶长、最大叶宽和茎高分别比对照降低了43. 45%、42. 22%、17. 63%和58. 10%,随后降低幅度变缓。(2)随着胁迫时间的延长,低温处理使1-SST基因和1-FEH基因表达量显著升高,且在胁迫第6天时达到最高值。1-SST基因和1-FEH基因的表达量分别是对照的45倍和7. 56倍; 1-FEH基因表达量显著低于1-SST基因的表达量,故低温胁迫下果聚糖代谢酶关键基因的表达过程是一个"以合成为主,以水解为辐"的过程。低温胁迫抑制了乐都紫皮大蒜幼苗的生长,胁迫第6天是幼苗响应低温的关键时期,并推测乐都紫皮大蒜主要通过增强果聚糖的合成来响应低温胁迫。     

干旱胁迫下甘蓝型油菜相关抗旱基因的表达分析

以抗旱性较强的甘蓝型油菜Holiday为材料,在开花初期对油菜进行干旱胁迫处理,采用RT-qPCR技术分析ABA2、BnSOS2、BnCS、CAM、CBF4、PIP1这6个油菜抗旱相关基因在干旱胁迫第1天、3天、5天、7天在根、茎、叶、花和青荚中的表达量.结果表明,干旱胁迫下,6个抗旱相关基因在油菜的不同器官中均出现了上调表达;在不同干旱胁迫下,各基因表达量呈现不同的变化趋势;在相同的器官中,各基因的表达量存在明显的不同,累积表达量表现为根中ABA2最大、CBF4最小,茎中CAM最大、CBF4最小,叶中PIP1最大、ABA2最小,花中CBF4最大、BnSOS2最小,青荚中BnCS最大,CBF4最小.说明植物在受到干旱胁迫时,不同的抗旱途径对干旱胁迫的响应程度是不同的;不同器官中各抗旱相关基因与胁迫时间的相关性分析表明,CAM基因在茎中的表达量、CBF4基因在花中的表达量与胁迫时间呈显著正相关.     

东南景天SaWRKY7基因对镉胁迫的响应研究

【目的】镉对植物具有高毒性,WRKY转录因子广泛参与植物逆境胁迫。研究镉诱导下WRKY基因的胁迫响应和抗性机制。【方法】以超积累型东南景天为试材,通过PCR克隆得到1个东南景天WRKY转录因子家族基因序列,结合生物信息学方法,分析其蛋白质结构和亲缘关系,构建GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白,观察其亚细胞定位,利用酵母验证其转录激活活性,通过qRT-PCR分析在镉胁迫下该基因的表达特性和组织特异性。【结果】获得了1条新的东南景天WRKY转录因子家族基因并命名为SaWRKY7,包含完整的开放阅读框,长度为1 011 bp,共编码336个氨基酸,为WRKY基因家族Ⅱd成员。SaWRKY7定位在细胞核,属于核蛋白,不具有转录自激活活性。SaWRKY7在东南景天的根、茎、叶中均有表达,且在根中相对有较高的表达量。与对照相比,在100 μmol/L CdCl₂处理0.5 h时,SaWRKY7在根茎叶中有较高的表达量,随后逐渐降低,属于早期诱导表达基因。【结论】SaWRKY7为WRKY转录因子家族成员,该基因定位在细胞核,不具有转录自激活活性,在早期响应镉胁迫诱导表达,推测其可能在东南景天镉积累或镉耐受过程中发挥重要作用。     

低氮胁迫下栽培大豆和野大豆幼苗适应性转录组学比较研究

以栽培大豆和野大豆幼苗为实验材料，人工模拟低氮胁迫，采用转录组测序技术(RNA-seq)测试分析了胁迫处理下栽培大豆和野大豆幼苗在转录水平发生的变化，揭示了野大豆抵御低氮胁迫的分子机制.结果表明：野大豆能够通过促进根系生长维持较高的根冠比、增大根系与营养物质的接触面积吸收更多的氮抵御低氮胁迫.低氮胁迫下野大豆和栽培大豆幼苗叶片中分别有182个和733个差异表达基因，根系中分别有807个和621个差异表达基因.野大豆通过调控NRT1、NRT2和AMT蛋白家族相关基因的表达来抵御低氮胁迫.叶片中AP2/ERF-ERF、C2H2、C3H、GRAS、MYB、NAC、TIFY和WRKY转录因子，根系中C2H2、GRAS、MYB、NAC、TIFY和WRKY转录因子在野大豆抵御低氮胁迫的过程中起调控作用.野大豆抵御低氮胁迫的关键是增强叶片中的半胱氨酸、蛋氨酸代谢和谷胱甘肽代谢，增强根系中的半胱氨酸、蛋氨酸、氰基氨酸代谢，N-聚糖生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢及糖酵解.     

拟南芥转录因子CBF1基因杂交狼尾草的转化

CBF1转录激活因子是一类存在于拟南芥中受低温诱导的反式作用因子,能有效提高植物抗低温、抗干旱的能力.因此以拟南芥叶片为材料,通过PCR方法成功地克隆CBF1转录因子基因,并将其连接到植物表达载体pBI121上,通过农杆菌介导法转化杂交狼尾草叶片,成功获得转基因再生植株.     

AtchyB基因过表达对转基因洋桔梗抗氧化性的影响

由转β-胡萝卜羟化酶(AtchyB)基因的洋桔梗获得T1代转基因系,经PCR及northern blot技术检测后,对L8和L25两个转基因系及野生对照进行UV-B紫外胁迫处理.检测胁迫前后植株的类胡萝卜素、氧化酶(SOD、POD、CAT)和MDA及光合作用相关参数值.对比结果表明:1胁迫使得基因表达水平强化,转基因系中与抗氧化性相关类胡萝卜素显著高于对照,叶黄素循环池显著放大;2酶促系统对非酶促系统产生影响,使得转基因系与对照间的酶活力存在差异,和对照比,转基因系的SOD对紫外胁迫更敏感,但MDA无显著差异,这可能是两种系统协调作用的结果;3胁迫后,转基因系Fv/Fm和ΦPSⅡ值显著高于对照,体现出其更强的抗氧化性.qP值显示AtchyB基因过表达对洋桔梗光化学猝灭影响不大,其中L25的NPQ显著高于对照,可见其非光化学淬灭能力有所提高.     

麻疯树JcCBF3基因的克隆及其抗寒功能初探

从麻疯树中克隆到一个CBF3基因,命名为JcCBF3,ORF全长678bp,编码225个氨基酸;氨基酸序列同源性比对结果显示JcCBF3与其他物种CBF序列具有较高的同源性,与木薯和橡胶树的相似度最高,达到79%和74%.RT-qPCR结果表明低温胁迫12h后JcCBF3基因的表达量达到峰值,为对照的62倍.将JcCBF3构建到植物过表达载体pBI121上并成功转化烟草.低温处理下转基因烟草幼苗的游离脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性的增幅均大于野生型烟草,并且JcCBF3基因的过表达增强了含有CRT/DRE元件的下游抗性基因的表达.     

水稻盐敏感突变体ssm1的生理指标分析

探索水稻对盐胁迫的耐受机制,培育高产耐盐水稻是提高盐碱土地利用率的重要手段.通过对甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的种库进行耐盐筛选获得了盐敏感突变体ssm1,该突变体同时具有叶片早衰表型.进一步研究发现,盐处理后突变体中H_2O_2和MDA含量显著高于野生型,总抗氧化能力显著低于野生型.此外,盐胁迫处理6 h后耐盐相关基因MYB2和HKT1.1表达量下调.推测ssm1突变体的盐敏感表型是由于突变体中H_2O_2和MDA的积累导致的膜脂过氧化或膜系统受损,继而造成大量外源Na~+进入细胞导致细胞死亡.通过对盐敏感突变体ssm1的生理指标分析,探究SSM1参与水稻盐胁迫耐受机制,为培育高产耐盐水稻品种提供重要理论依据.     

番茄SlWRKY80基因共抑制表达影响转基因植株抗逆性的研究

利用植物基因工程技术,构建了植物表达载体pBI121-35S::SlWRKY80,并利用根癌农杆菌介导法转化番茄,得到转基因阳性植株.通过生物信息学分析SlWRKY80蛋白序列与9种物种进行同源比对,发现高度保守的WRKY结构域和C2HC型锌指结构.采用Real-Time PCR分析转基因植株中SlWRKY80mRNA的表达情况,结果显示SlWRKY80的表达量显著下调,出现共抑制现象.用不同浓度的NaCl对转基因种子和野生型种子进行胁迫处理,结果显示在NaCl浓度为100mM和150mM时,转基因幼苗初生根的长度与野生型相比相对较短,显示SlWRKY80对初生根的生长有促进作用;用Pto DC3000接种转基因植株和野生型植株叶片,结果显示野生型植株叶片中细菌增殖率是转基因植株叶片中的2.5倍,显示SlWRKY80在番茄抗病信号转导中扮演负调控作用.     

甘蓝型油菜BnbHLH92基因的克隆与表达分析

为研究甘蓝型油菜bHLH转录因子的功能,采用同源克隆技术从甘蓝型油菜中克隆了5个BnbHLH92基因全长cDNA序列,分别命名为BnbHLH92-1、BnbHLH92-2、BnbHLH92-3、BnbHLH92-4、BnbHLH92-5,其编码区长度分别为738,657,684,741,717bp.qRT-PCR实验表明,除BnbHLH92-1外,其它的BnbHLH92基因主要在抽薹期和花期的根中表达,BnbHLH92-1主要在抽薹期和花期的根以及二叶一心期的叶中表达.非生物胁迫显著影响BnbHLH92基因的表达,使其表达量升高.低温胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后4、6、6、6、6 h表达量达最高.高温胁迫下,5个BnbHLH92基因分别在胁迫后2、6、6、8、4 h表达量达最高.盐胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后6、6、24、24、24 h表达量达最高.在ABA诱导下BnbHLH92基因表达量也有不同程度的增加,分析发现BnbHLH92基因的启动子序列上存在ABA响应元件(ABRE).     

紫雨桦耐盐性及花色苷合成相关基因的表达特性

【目的】探讨紫雨桦的耐盐性与花色素苷合成相关基因的相关性,为揭示紫雨桦的耐盐机理提供参考。【方法】以紫雨桦和垂枝桦(对照)为试材,测定盐胁迫下其叶绿素荧光参数及生理指标的变化,同时采用qRT-PCR方法分析紫雨桦和垂枝桦中查耳酮合酶基因(CHS)、二氢黄酮醇还原酶基因(DFR)、花色素苷合成基因及MYB转录因子家族基因的表达特性。【结果】经质量分数0.8%NaCl胁迫12 d后,紫雨桦叶片花青素含量指数显著高于垂枝桦,是垂枝桦的3.4倍,其盐害指数显著低于垂枝桦,胁迫12 d的联苯胺蓝(DAB)和氮蓝四唑(NBT)染色显示,紫雨桦叶片中O^-₂和H₂O₂的累积少于垂枝桦; 在叶绿素荧光参数方面,NaCl胁迫12 d时,紫雨桦的F_v/F_m值仍在正常值范围内,与胁迫0 d比较,其qP和Φ_PSⅡ值的降幅也显著小于垂枝桦(P<0.05),紫雨桦的NPQ较0 d提高了282.29%,升幅显著高于垂枝桦(P<0.01)。 0.8%NaCl胁迫下CHS、DFR花色素苷合成基因及MYB转录因子家族基因的表达特性是:紫雨桦中的BpMYB10、BpCHS2和BpDFR5基因表达规律明显不同于垂枝桦,NaCl胁迫下上述3条基因持续高表达。【结论】 富含花青素的紫雨桦能够耐受一定浓度范围的NaCl胁迫,紫雨桦中的BpMYB10、BpCHS2和BpDFR5基因表达规律明显不同于垂枝桦,这些基因可能与花青素的合成密切相关,花色苷可增强紫雨桦清除活性氧自由基的能力,减缓膜质氧化,提高其耐盐性。     

沙田柚WRKY转录因子的克隆与序列分析

利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序,差异分析得到沙田柚WRKY转录因子的序列。该基因的全长序列为1 178bp(GenBank accession No.KU173833),含有993bp的开放阅读框(ORF)可编码330个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为37.00ku,理论等电点为5.79。与未授粉的花柱相比,沙田柚异花授粉1、2、3d花柱中WRKY转录因子基因的表达量(RPKM)分别为5.67、26.04、17.08;而自花授粉1、2、3d花柱中WRKY转录因子基因的表达量(RPKM)分别为15.67、14.96、3.89。氨基酸序列分析表明,该氨基酸序列与甜橙、金桔的同源性分别为98%、97%。系统进化分析发现沙田柚WRKY转录因子与甜橙、金桔的亲缘关系很近,属于一个分支。     

碳饥饿和盐胁迫处理过表达OsAtg8a水稻转化植株的基因表达分析

为了探究Os Atg8a在水稻碳饥饿和盐胁迫过程中的作用,通过农杆菌介导法获得了过表达Os Atg8a的水稻转化植株.分别对野生型植株和转基因植株进行碳源饥饿处理0、8、16、24和48 h,发现碳饥饿处理时间为0、8、16、24 h时野生型植株和转基因植株中基因表达量均没有发生明显变化,处理48 h时,过表达Os Atg8a植株的Os Atg1a、Os Atg4a、Os Atg8a、Os Atg13a、Os Atg16a和Os TOR基因表达量均显著高于对照植株.盐胁迫处理组合下,发现250 mmol/L Na Cl处理4 h的过表达Os Atg8a植株中,Os Atg8a和Os Atg16a的表达量较未处理的转基因植株表达量明显增加,Os Atg8a的表达量较野生型增加了36倍.针对过表达Os Atg8a转化植株在无碳源和高盐胁迫过程中相关自噬基因表达量明显升高的结果,推测Os Atg8a基因在水稻抗非生物胁迫的过程中具有重要的作用.     

药材甲热激蛋白基因SpHsp60的克隆及温度胁迫下的表达

本研究采用RT-PCR技术克隆了药材甲热激蛋白60(Heat shock protein 60,Hsp60)基因的cDNA全长序列,命名为SpHsp60(GenBank登录号:KX778623).氨基酸序列分析表明SpHsp60具有Hsp60基因家族高度保守的基序,实时定量PCR技术检测了不同温度胁迫后该基因的表达量,结果表明:-5℃和0℃低温处理2h,药材甲成虫体内的SpHsp60的表达量均显著高于对照组,且42℃高温处理2h后的表达量也显著高于对照组.说明SpHSP60与药材甲应对极端温度胁迫相关.     

低温驯化提高冷胁迫下牛皮杜鹃光合作用的研究

以长白山牛皮杜鹃为实验材料,探究了低温驯化对牛皮杜鹃光合作用的影响及H_2O_2信号在低温驯化中的作用.将牛皮杜鹃分别进行低温驯化培养(18/16℃)和正常培养(25/18℃).8个月后,将实验材料分为4组,每组12棵,低温驯化植株分别用蒸馏水和50μmol/L的二联甲苯(DPI,一种NADPH氧化酶的抑制剂)预处理3 d,作为CA组和DPI+CA组,未驯化牛皮杜鹃为NA组和对照组(Control).DPI+CA,CA和NA组同时4℃冷胁迫48 h,恢复培养24 h.通过对叶绿素荧光参数进行测定分析,结果表明:冷胁迫会使牛皮杜鹃的光系统Ⅱ受损导致光合能力下降,表现在Fo、Fm、qP的下降以及NPQ的增加,这些光合参数变化的原因是光抑制的产生和光能利用率的下降.低温驯化可以有效缓解冷胁迫对牛皮杜鹃的光系统Ⅱ产生的影响,减轻光抑制、提高光能利用效率,光合作用增强.CA+DPI组的各参数结果说明H_2O_2信号参与了冷胁迫下低温驯化使牛皮杜鹃光合作用提高的过程,在低温驯化调控中发挥积极作用.本研究为提高植物抗寒性的研究提供理论基础.     

Th2CysPrx基因提高酿酒酵母多种胁迫耐受性研究

【目的】过氧化还原蛋白是生物体调节体内氧化还原系统的一种重要蛋白质,在植物生长代谢中起重要作用。前期研究发现过表达刚毛柽柳Th2CysPrx基因的烟草和柽柳中4种抗氧化酶基因(ThGSTZ1、ThGPX、ThSOD和ThPOD)的表达水平上调, 转基因植株的NaCl胁迫耐受性提高。本实验探究Th2CysPrx基因除了响应NaCl胁迫应答,是否还参与其他盐胁迫和其他胁迫的应答。 【方法】将Th2CysPrx构建到pYES2酵母表达载体上,转化到酿酒酵母INVSC1细胞中,分析比较重组酵母(pYES2-Th2CysPrx)和对照酵母(pYES2)细胞在各种非生物胁迫后的生长情况。【结果】过表达Th2CysPrx基因的重组酵母细胞在低温、KCl和LiCl胁迫后存活率与对照相比差异不显著;但H₂O₂、NaCl或NaHCO₃胁迫后酵母细胞的存活率显著提高。此外,高于0.5 mol/L山梨醇或高温(达到44 ℃),或低于质量分数0.007% CdCl₂胁迫后,过表达Th2CysPrx基因能显著提高重组酵母的细胞存活率。【结论】Th2CysPrx基因可以显著增强酵母细胞对NaCl和NaHCO₃胁迫的耐受能力,以及特定的渗透胁迫、高温胁迫、氧化胁迫和重金属胁迫的耐受能力,但对低温、KCl和LiCl胁迫耐受能力无明显影响。     

茎瘤芥BjMYB1两个转录本的克隆与遗传转化研究

本研究根据茎瘤芥转录组测序筛选获得了一个MYB基因片段.通过RACE的方法,克隆得到了两条长度分别为975bp和864bp的全长序列,分析发现可能为茎瘤芥MYB基因的两种不同选择性拼接形式,并命名为BjMYB1-3和BjMYB1-4.对BjMYB1-3和BjMYB1-4做组织表达分析,发现这两个转录本在茎中特异表达.针对BjMYB1-3和BjMYB1-4的亚细胞定位分析,显示BjMYB1-4定位于细胞核,BjMYB1-3部分定位于细胞核.构建BjMYB1-3和BjMYB1-4的超表达载体转化拟南芥,结果显示相比于野生型拟南芥,BjMYB1-3超表达转基因株系生长状态更好,而BjMYB1-4超表达转基因株系没什么明显变化,说明BjMYB1-3在植株的生长发育过程中起着一定作用.     

地下水位深度对芦苇生长与叶绿素荧光参数的影响

在直径35.5 cm、深100 cm的试验桶内装填80 cm高的江沙,调节并控制地下水位深度分别为-60 cm、-40 cm、-20 cm和0 cm,引种芦苇根状茎,模拟研究江滩湿地地下水位深度变化对芦苇生长发育的影响,为江滩湿地生态系统保育和植被恢复重建提供依据.试验结果表明:随着地下水位深度降低,芦苇植株高度和节间数极显著降低(P<0.01),叶片叶绿素含量减小,植物通过形态调节和减少色素含量来减少叶片对光能的捕获;最大PSⅡ的光能转换效率(Fv/Fm)下降;电子在光合链中的传递速率(rETR)下降,参与CO2固定的电子减少;吸收的光能用于光化学电子传递的份额(qP)减少;光能以热的形式耗散掉的份额(qN)增多,光合作用下降.-60cm处理组芦苇植株在试验31 d相继死亡,持续的低地下水位深度使PSⅡ遭到损伤,芦苇生长受到抑制.其它各处理组随着试验时间的延长,植株进一步生长,Fv/Fm值、rETR值和qP值上升,qN值下降,但组间差异减小,地下水位深度对植株生长影响减弱.