全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞

为体外建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞的方法。采用全骨髓贴壁法分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,传至第三代后运用流式细胞术检测第三代细胞的表面抗原;取第三代细胞,分别向成骨、成软骨诱导分化。结果显示:流式细胞术检测CD29、Scal-1、CD45的阳性率分别为97.1%、87.1%、0.7%;在成骨培养基的诱导下,碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;在成软骨培养基的诱导下,阿利辛蓝染色阳性。由此可知,通过此方法可以获得较高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞,并且具有多向分化潜能。     

人胎骨髓MSCs的分离鉴定及其向脂肪和成骨细胞的分化

目的:分离鉴定人胎骨髓中的间充质样干细胞(m esenchym al-like stem cell,MSCs),探索其体外培养的生物学特性。方法:利用细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎骨髓间充质样干细胞;利用流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨方向分化,并利用特异性细胞化学染色法加以鉴定。结果:从人胎骨髓中成功分离、纯化得到间充质样干细胞,P4代细胞有92.3%的细胞处于G0/G1期;P5代细胞有96.1%的细胞处于G0/G1期;流式细胞仪检测P3代细胞结果显示:人胎骨髓MSC表达CD15、CD29、CD44、CD105、CD106和CD166,不表达造血细胞标志CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L。在经典的诱导条件下,人胎骨髓MSCs可迅速向脂肪及成骨方向分化。结论:人胎骨髓中含有丰富的间充质样干细胞,具有较强的多向分化潜能,且免疫原性弱,是组织工程的较为理想的种子细胞。     

人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定

目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.     

人足月胎盘间充质干细胞的分离纯化及其特征

目的:从人足月胎盘中分离、培养间充质干细胞(MSCs),并研究其生物学特征.方法:将人足月胎盘组织经胶原酶Ⅱ消化和贴壁培养法获取间充质干细胞,运用活细胞计数和碘化丙啶(PI)检测其增殖能力;采用流式细胞术检测其细胞表面标志的表达;用地塞米松、抗坏血酸及β-磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用Yon Kos-sa染色进行鉴定;用地塞米松与胰岛素诱导其向脂肪细胞分化,并以油红O染色进行鉴定.结果:从人足月胎盘分离的间充质干细胞为梭形贴壁细胞,增殖能力较强;强表达CD44、CD29,不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR;经诱导后向脂肪细胞及成骨细胞分化,油红O染色、Von Kossa染色为阳性.结论:人足月胎盘中也富含间充质干细胞,与其他来源的间充质干细胞的生物学特征相似,可能是组织工程新的干细胞来源.     

肌腱干细胞修复肌腱损伤动物模型

文章进行体外分离培养鸭胚肌腱干细胞，构建其最佳培养体系，采用免疫组织化学鉴定、RT-PCR、流式阳性率等实验方法检测肌腱干细胞表面标志物的表达；将肌腱干细胞向成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞诱导分化，表明其具有多向诱导分化潜能；运用I型胶原酶构建小鼠肌腱组织急性损伤动物模型.结果：肌腱干细胞体外分离培养至31代；CD44、CD105、CollagenI、CollagenIII、Tenascin-C等表面标记物呈阳性表达；CM-Dil标记的肌腱干细胞移植到小鼠肌腱损伤部位，能够稳定迁移到损伤组织周围并增殖分化.     

脐带源间充质干细胞的生物学性状及其成脂肪细胞诱导分化

以健康产妇脐带为材料分离脐带间充质干细胞,体外培养扩增传代,做细胞形态观察,计数细胞并绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪测定细胞周期以及免疫表型,测定细胞定向诱导分化成脂肪细胞的能力.发现人脐带源间充质干细胞能在体外培养扩增,可定向诱导分化为脂肪细胞并且具有和骨髓来源的间充质干细胞相似的生物学形态和抗原表型.成功建立了脐带源间充质干细胞系,可以作为干细胞研究和应用的新的材料来源.     

人骨髓间充质干细胞对小鼠神经干细胞增殖与分化培养的影响

通过在体外培养、鉴定人的骨髓间充质干细胞与小鼠神经干细胞,用骨髓间充质干细胞条件培养基分别在增殖与分化条件下对神经干细胞进行培养.发现,间充质干细胞条件培养基在增殖条件下能加快神经球内神经干细胞的迁移,使神经球解聚,对神经干细胞增殖没有影响;而间充质干细胞条件培养基在分化条件下,能增加神经干细胞向少突胶质细胞分化的能力,降低向星型胶质细胞的分化能力,对向神经元分化能力没有影响,间充质干细胞可能是通过促进神经干细胞迁移、分化而加快神经损伤的修复的.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶

目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)表达酪氨酸羟化酶,为帕金森病细胞移植替代治疗提供特异性分化的细胞.方法:在无菌条件下从SD大鼠的股骨中分离骨髓间充质干细胞,体外培养传3代后,用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和抗坏血酸诱导MSCs 表达酪氨酸羟化酶.在镜下,观察MSCs 在诱导前后的形态变化;用免疫荧光染色检测酪氨酸羟化酶的表达.结果:MSCs经诱导分化后,胞体逐渐变圆,并伸出神经轴突、树突样突起;免疫荧光化学表明细胞酪氨酸羟化酶染色呈强阳性反应.结论: SD大鼠骨髓间充质干细胞在体外能被定向诱导表达酪氨酸羟化酶,有可能为帕金森病治疗提供特异性分化的细胞.     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及生物性状研究

分离培养人骨髓间充质干细胞，研究其在体外生长增殖的生物特性。冲洗手术弃骨骨髓，获取骨髓间充质干细胞进行培养，倒置相差显微镜观察细胞生长情况，绘制生长曲线，免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原，进行染色体核型分析。冷冻保存细胞复苏后的生长状况观察。结果显示，原代和传代培养的细胞呈现梭形外观，具有较强的生长增殖能力；细胞CD44，CD54抗原表达阳性，CD34表达阴性。染色体核型分析表明是正常的人二倍体细胞。复苏细胞生物学特性无明显改变。     

神经元素3蛋白(Ngn3)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素表达细胞分化的初步研究

胰腺发育相关基因神经元素3（neurogenin3,Ngn3）,属于碱性螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）家族的转录因子,对胰腺内分泌细胞的发育及分化至关重要,且被认为是胰腺祖细胞的标志蛋白质．之前的研究发现,全长Ngn3蛋白具有蛋白质转导功能,可以高效进入多种真核细胞系．近年来多项研究显示,骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的多能干细胞．利用蛋白质转导技术,将体外表达纯化的胰腺发育重要因子Ngn3蛋白导人体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞中,诱导其向胰岛素表达细胞分化．结果显示,经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞出现细胞聚集生长现象,并有形状类似胰岛的细胞团出现．RT-PCR结果显示经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞可以有效表达胰岛素,并且一些β细胞相关基因如胰十二指肠同源盒基因-1（pancreatic-duodenal homeoboxl,Pdx-1）,神经分化因子（neurogenic differentiation,NeuroD）,同源结构域基因4（pairedboxgene4,Pax4）,葡萄糖转运体-2（gluoase transporter2,Glut-2）都有表达．细胞免疫荧光也可检测到胰岛素的表达．通过Ngn3蛋白质诱导分化大鼠骨髓间充质干细胞的初步研究,探索了应用骨髓间充质干细胞体外诱导分化获得胰岛素表达细胞的可行性,为糖尿病治疗提供一定的实验依据．     

人骨髓间充质干细胞体外扩增和向神经细胞定向诱导分化的研究

骨髓间充质干细胞(MSC)是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞,在体外不仅可以分化为间充质类细胞,而且可以分化为非间充质类细胞.研究了人骨髓间充质干细胞的体外分离、扩增和向神经细胞的定向诱导分化条件.从骨髓中分离MSC,用MesenCult培养基进行纯化和扩增培养.每扩增一代,细胞数量增加约2～3倍,在体外扩增12代后扩增约4.6×10 4 倍;诱导不同扩增代数的MSC向神经细胞分化,诱导后的细胞平均有80%以上呈现典型的神经元样表型.免疫组化法检测发现,神经元样细胞强表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶,组织化学法检测观察到神经元特有结构尼氏体,表明MSC在体外具有向神经细胞分化的潜能.     

小鼠骨髓间充质干细胞多潜能性的鉴定

目的:鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的多分化潜能的起因.方法:从成年小鼠骨髓股骨、胫骨中分离MSCs,并进行原代培养,分别于0、2、4、6、8、10 d提取总RNA,通过RT-PCR检测多潜能特征基因和相关因子、3个胚层特征基因的mRNA的表达情况,以判断MSCs的特性.结果:小鼠MSCs中表达多能性标记基因Oc...     

骨髓间充质干细胞向神经元细胞诱导分化的研究进展

骨髓间充质干细胞（MSCs）具有多胚层分化特性,是干细胞治疗的重要种子细胞之一。目前,大量体外及体内分化实验表明,MSCs在特定的细胞因子、生长环境及培养时间等条件下可以向神经元细胞分化,表现在其能表达神经元特异标志,并显示出神经元细胞的某些功能;对其分化的机制探索也在逐渐深入。但对于分化的持久性、具体机制如何等问题仍有待进一步研究。     

当归诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经元样细胞

研究当归体外定向诱导人脂肪间充质干细胞(AMSCs)分化的作用.自皮下脂肪组织获得梭形细胞,观察细胞生物学特征,免疫组化鉴定波形蛋白和CD44.AMSCs用25×10-6L/mL〖JP〗当归注射液预诱导24 h后,用100×10-6L/mL当归注射液不含血清的DMEM/F12进行诱导.光镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.人脂肪组织中能够分离培养出生长旺盛的脂肪间充质干细胞,当归诱导24 h后,部分AMSCs转变为神经元样细胞,出现突起,免疫细胞化学染色NSE呈阳性、GFAP阴性.人脂肪间充质干细胞在体外可被当归诱导分化为神经元样细胞 .     

人胎肝MSCs的分离、鉴定及其向脂肪和成骨细胞的分化

目的:分离纯化人胎肝中的间充质样干细胞(mesenchymal-like stem cells,MSCs),观察化学因子诱导其定向分化的作用,并初步鉴定其生物学特性.方法:利用二步离心法、羟乙基淀粉沉淀法及细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎肝MSCs;流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨细胞分化并加以鉴定.结果:从人胎肝中成功分离纯化得到MSCs,P3代细胞有91.2%的细胞处于GO/G1期;表达CD29、CD44、CD105和CD166,不表达造血细胞标志CD15、CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L.在经典诱导条件下,人胎肝MSCs可向脂肪及成骨细胞分化.结论:人胎肝中含有较丰富的MSCs,人胎肝MSCs具有多向分化潜能,且免疫原性弱,是组织工程和细胞治疗较为理想的种子细胞.     

猪脂肪间充质干细胞分离培养及成骨诱导

脂肪间充质干细胞(AMSCs)是一类存在于脂肪组织中具有多向分化潜能的干细胞．近年来的研究证明,脂肪组织具有取材方便和干细胞含量高的优势,在研究与应用领域较骨髓干细胞具有更广阔的应用前景．猪是一种比啮齿类等更接近人类的动物,具有较强的脂肪沉积能力．文中探讨了猪脂肪间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件．采用I型胶原酶消化分离脂肪基质微管成分(SVF),传代培养扩增,流式细胞仪检测细胞表面标记．取第5代AMSCs,以含地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油钠的培养基诱导培养,光学显微镜下观察,诱导后的细胞呈现典型的成骨细胞样改变．分化细胞碱性磷酸酶(AIP)染色呈阳性,RT-PCR检测到I型骨胶原(COL-I)和骨钙素(OCN)表达,结果表明可以从SVF中分离培养出AMSCs,经传代后可提高其纯度．经流式细胞仪检测,其CD105和CD44表达呈阳性,CD14,CD34,S-100,HLA-DR呈阴性,在合适的诱导条件下,可向成骨细胞分化．     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞rMSCs的方法,检测传代细胞的细胞周期,并分析部分细胞表型,对rMSCs进行初步的鉴定。方法:密度梯度离心结合贴壁培养法分离培养rMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,免疫组化检测细胞表面抗原,流式细胞仪检测细胞周期。结果:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞呈均一的成纤维细胞样,细胞周期显示90.16%P1代细胞处于G0/G1期,免疫组化结果为:CD44、CD29阳性、CD34阴性,说明培养的细胞即非造血干细胞,也非成纤维细胞。结论:本实验分离培养的细胞群与间充质干细胞的生物学特性吻合,说明密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞稳定表达CD44、CD29,是实用、可行的方法,所培养的细胞可用于细胞移植等研究。     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养方法的建立

为建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养的方法,为后续细胞共培养奠定实验基础。采用通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,进行形态学观察,并应用流式细胞术检测BMSCs免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的第三代BMSCs向脂肪细胞和成骨细胞方向进行诱导分化,诱导21 d后的脂肪细胞应用油红O染色进行鉴定,成骨细胞应用茜素红染色进行鉴定;将获取的骨髓细胞液按照造血系单核干细胞诱导培养法向破骨细胞方向进行诱导分化,于28 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色进行鉴定。结果显示,BMSCs体外培养14 d具有独特的细胞免疫学表型,流式细胞术检测,CD29+、CD44+表达量分别为97.92%和89.32%;在脂肪培养基诱导下,油红O染色阳性。在成骨培养基诱导下,茜素红染色阳性;骨髓细胞液在破骨培养基诱导下,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。由此可知,建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞诱导分化的培养方法。     

人脐带间充质干细胞植入大鼠肝切模型中的分化研究

目的:探讨携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSC)植入肝部分切除大鼠体内后,其在大鼠肝脏中的分化能力。方法:首先将人脐带间充质干细胞分离培养并且进行表面标志物检测,以携带EGFP标记的慢病毒载体(lentiviral vector,LV)转染HUC-MSC。将SD大鼠随机分成3组:空白组、模型组及实验组,3组均建立大鼠肝切模型,空白组不注入HUC-MSC,模型组注入未标记的HUC-MSC,实验组注入EGFP标记的HUC-MSC。3个月后分离大鼠肝脏细胞,继而进行相关指标检测。冰冻切片HE染色观察病理结构,流式细胞仪检测间充质干细胞的纯度及CD90在肝细胞中的表达量,荧光显微镜观察EGFP在肝组织的表达。结果:病理切片显示带有EGFP的人脐带间充质干细胞在组织上表达,其中一部分聚集于血管内,形成栓子,附在血管壁上;手术后各组大鼠的肝都有炎症反应,但组织结构良好,各组间未见明显的形态学差异。HUC-MSC高表达CD44、CD29、CD105和CD90,不表达CD34、CD45、CD106、CD31、CD40和HLA-DR。流式结果显示模型组EGFP的表达率为(0.27±0.21)%,实验组为(11.68±1.46)%,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。CD90的表达结果显示模型组CD90的表达量较高,为(0.843±0.146)%,实验组低表达CD90,阳性率为(0.026±0.017)%,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。结论:人间充质干细胞可以分化为肝细胞,LV介导EGFP标记的人间充质干细胞可以稳定分化为肝细胞并且被检测到,但是易于形成栓子,肝细胞低表达CD90,为以后干细胞的分化提供实验依据。     

红景天苷对BMSC生物学特性影响

目的：研究红景天苷对骨髓间充质干细胞（Bonemesenchymalstemcells,BMSCs）生物学活性影响。方法：采用贴壁法分离培养BMSCs,检测细胞表面分子表达对所获干细胞进行鉴定。以终浓度为10¨g／mL红景天苷与BMSCs共培养,通过形态学观察和MTT法分析研究其对BMSCs生物学特性影响。结果：成功培养出BMSCs,免疫荧光染色显示,培养的第3代BMSCs表达CD29、CD44干细胞标志。10μg／mL红景天苷与BMSCs共培养后,较对照组细胞生长更为旺盛,更为规整,形成典型的“鱼群状”。生长曲线显示,实验组细胞较对照组生长稳定,增殖能力活跃。结论：10μg／mL红景天苷可促进BMSCs增殖分化,又不影响细胞增殖分化等生物学特性。