大鼠半月板纤维软骨细胞的分离、培养与鉴定

探讨体外大鼠半月板纤维软骨细胞分离培养与鉴定的实验方法,观察不同代次间细胞的形态学特征.手术分离大鼠双膝内外侧半月板,采用胰酶和Ⅱ型胶原酶消化法提取细胞,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光法鉴定细胞,低糖DMEM完全培养液常规培养.结果表明,原代半月板细胞形态呈多角形,轮廓清晰,8～10d可铺满瓶底;传代后的1～3代细胞,其贴壁及增殖能力加强,生长状态良好;传至4～5代尤其是第5代之后,细胞表型不稳定,密度稀疏,形态以长梭形为主且不规则,清晰度下降,传代周期延长;细胞鉴定结果呈阳性.双酶消化和低糖DMEM完全培养液常规培养可以获得具有良好生物学特性的半月板细胞,第4代之前的半月板细胞可以为运动损伤的组织工程学研究提供种子细胞.     

实验用五指山小型猪胚胎生殖细胞的分离培养

目的对从猪的原始生殖细胞分离获得胚胎干细胞的方法进行初步研究。方法胎儿取自怀孕26～28d的实验用五指山母猪。分离胎儿生殖嵴获得PGCs,接种于STO饲养层上,以DMEM+2mmol/L谷氨酰胺+0.1mmol/L非必需氨基酸+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素+15%FCS作为培养基,对细胞进行培养传代。结果培养的细胞传至4～5代,形态多样,经AKP染色、SSEA-1免疫荧光染色、Oct-4免疫荧光标记等方法鉴定为阳性,具有胚胎干细胞的特征。     

原代HUVECs分离培养关键影响因素分析

内皮细胞与心脑血管病变和癌症发生密切相关,人脐静脉内皮细胞(HUVECs)是最佳的研究工具.针对影响原代HUVECs培养的主要因素提出解决办法,建立稳定可靠的原代HUVECs培养方法.方法是取自剖宫产手术的脐带,消化法分离HUVECs,M199培养传代.针对消化条件、培养液、培养瓶/板处理、传代时间、胰酶浓度等因素考察.结果表明培养瓶/板预先2%明胶包被,采用I型胶原酶分离消化,含10%胎牛血清的M199培养,24h后换液,细胞生长至紧密后传代,O.05%胰酶传代消化,取4～5代细胞用于实验.认为经过控制原代HUVECs培养的主要影响因素,建立了不易污染、纯活度高的原代HUVECs培养方法.     

小鼠精原干细胞的体外培养与鉴定

建立一种简单、有效体外分离和培养精原干细胞（Spermatogonia stem cell,SSCs）的方法。采用酶消化6—8d新生小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液后进行培养,碱性磷酸酶（AKP）染色和间接免疫荧光对培养的细胞进行鉴定;结果显示：SSCs培养3～5天可观察到细胞克隆的产生,AKP染色强阳性;间接免疫荧光显示GCNF阴性,oct-4、c—kit均呈阳性反应。由此可知以DMEM＋15％胎牛血清＋白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）＋L-谷氨酰胺等为培养基,成功建立了精原干细胞的体外培养体系。     

小鼠胚胎干细胞建系新方法的初步研究

通过对小鼠胚胎着床初期子宫组织块的培养及内细胞团的分离，探讨利用该方法获得胚胎干细胞的可能性，我们用这种方法已建立了一株小鼠胚胎干细胞系，传至第10代，AKP染色细胞呈强阳性，RT—PCR证实Qct-4表达强阳性。结果表明，利用这种方法获得胚胎干细胞是可行的，与传统方法相比，这种新方法极大简化了实验步骤，降低了实验技术难度。     

Ⅱ型胶原诱导的关节炎大鼠滑膜成纤维细胞的培养、纯化和鉴定

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)病人滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)是研究RA发病机制和进行RA药物筛选的最理想的细胞来源.但是对于众多非医疗机构的高校和科研院所而言,由于RA病人滑膜组织不易获取而难以进行细胞水平的操作.因此,建立胶原诱导的关节炎大鼠(Collagen-induced arthritis,CIA)模型,成功分离膝关节滑膜组织并进行滑膜成纤维细胞的原代培养和纯化,将有效解决RA FLS的来源问题,为后续实验奠定基础.本实验通过皮内和皮下两次注射鸡Ⅱ型胶原诱导Wistar大鼠罹患关节炎,通过关节炎指数评分和膝关节HE染色明确CIA模型的建立;分离膝关节滑膜组织,采用Ⅱ型胶原酶和无EDTA胰酶消化法分离细胞并进行传代培养,传至第三代时,细胞免疫荧光检测细胞中VCAM-1蛋白含量以鉴定细胞纯度.结果显示,滑膜组织经过消化和培养后得到大量大鼠滑膜成纤维细胞;在显微镜下观察所得细胞呈梭形树突状,具有成纤维样细胞特征;VCAM-1蛋白阳性细胞达98%以上,确证所分离细胞为滑膜成纤维样细胞,且纯度极高.本研究建立了较简便快捷地获得大量滑膜成纤维细胞的方法,为RA的发病机制研究和药物防治提供了丰富的实验材料.     

条件培养液诱导躯干部神经嵴干细胞向雪旺细胞分化的实验研究

目的:利用雪旺细胞条件培养液诱导躯干神经嵴干细胞向雪旺细胞方向分化,为组织工程化人工神经提供更好的种子细胞。方法:组织块法获取向躯干神经嵴干细胞,并进行免疫细胞化学双重染色鉴定,胶原酶消化传代并将其置于雪旺细胞条件培养液,4周后行S-100和MBP免疫细胞化学染色来鉴定细胞类型。结果:躯干神经嵴干细胞在雪旺细胞条件培养液中可存活、增殖,并且MBP染色为阳性,表明可定向分化为功能性的雪旺细胞。结论:将传代的躯干神经嵴干细胞置于雪旺细胞条件培养液中可使其分化为功能性的雪旺细胞。     

端粒酶转染防治角膜内皮失代偿的研究

目的评价端粒酶转染对角膜内皮细胞形态和功能的影响。方法将体外培养的猫角膜内皮细胞随机分为3组,兔端粒酶基因转染组、正常对照组和表皮生长因子组。培养30代后观察传代细胞形态和细胞周期各时相细胞比例的变化,检测端粒酶逆转录酶蛋白和Ⅳ型胶原的表达。结果兔端粒酶基因转染组细胞数目较正常对照组和表皮生长因子组增多,伸展贴壁能力增强,表型正常,G2～M期和S期细胞比例显著增加,端粒酶逆转录酶蛋白和Ⅳ型胶原的表达也较正常对照组增多。结论兔端粒酶转染可以促进猫角膜内皮细胞增殖且表型正常,可以增强其伸展粘附能力和分泌功能,有利于防治角膜内皮失代偿。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨新生大鼠海马神经干细胞(NSC)的体外培养和诱导分化的条件和特点.方法 分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27,联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法 行巢蛋白(Nestin)、5-溴脱氧尿苷(BrdU)、β-Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)、波形蛋白(Vimentin)和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定.结果 体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代.鉴定为Nestin染色阳性细胞和5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞(Tuj-1染色阳性细胞)、神经胶质细胞(Vimentin染色阳性细胞)和少突胶质细胞(Calc-C染色阳性细胞).结论 采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马神经干细胞.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的研究

目的：探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（ＭＳＣs）向胰岛β样细胞分化。方法：在无菌条件下从正常成人骨髓中分离间充质干细胞,体外培养传3代后用表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导MSCs向胰岛β样细胞分化。观察MSCs在诱导前后的形态变化;用胰岛素免疫细胞化学染色检测胰岛素的表达;用双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞。结果：未经诱导的MSCs在培养体系中呈贴壁生长,长梭形,经诱导分化后,细胞逐渐变圆,并聚集成团;胰岛素免疫细胞化学表明细胞团内的细胞呈胰岛素染色强阳性反应：双硫腙染色阳性。结论：人骨髓间充质干细胞可在体外被定向诱导分化为胰岛β样细胞。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BMU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimenfin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（GMc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马神经干细胞。     

恒河猴牙髓干细胞的牙向分化

将恒河猴牙髓剪碎,用酶消化后培养获得恒河猴牙髓干细胞,用细胞免疫荧光的方法鉴定干细胞表面标记基因的表达,对分离的细胞进行成脂成骨的诱导,同时将细胞与支架混合后移植裸鼠皮下.结果发现,分离的细胞能持续传代,能被条件性地诱导成脂和成骨,能表达CD146,OCT4,SSEA4,STRO1等干细胞的标记基因,细胞与支架移植体内能分泌形成牙本质.结果表明酶消化法能够成功分离恒河猴的牙髓干细胞,该细胞在体内能分化形成牙本质.实验结果为该细胞进一步作为种子细胞用于牙齿再生研究奠定了实验基础.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的:建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞(PCASMC)的技术方法并观察其生长特征.方法:酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征.结果:分离培养的细胞3d后呈梭形生长,7~8d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察3~5d即可见典型"峰-谷"状生长;免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率为97.5%;细胞生长曲线近似"S"形.结论:本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型.     

人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化的研究

目的:探讨早孕蜕膜组织分离子宫内膜间质干细胞及子宫内膜间质干细胞向子宫内膜分化的方法.方法:胶原酶Ⅰ法消化早孕人流子宫蜕膜组织,贴壁法分离子宫内膜间质干细胞,传代纯化至第2代,流式细胞仪检测其表面抗原.细胞免疫组织化学法检测角蛋白(CK)、波形蛋白(VIM)的表达.取第2代细胞,接种于24孔培养板爬片.实验分两组:单纯培养基组,细胞因子组即分别加入质量浓度均为10 ng/mL TGF-β、EGF与PDGF-BB.培养至第6天,采用免疫细胞化学法检测子宫内膜上皮标记物CK18和间质标记物VIM的表达.结果:胶原酶Ⅰ酶消化后贴壁培养法能稳定从人早孕蜕膜组织中分离出子宫内膜间质干细胞;子宫内膜间质干细胞不表达CD34、CD45、CK,强表达CD73、CD90、HLA-I;细胞免疫化学法检测干细胞CK阴性,VIM阳性.细胞免疫化学染色提示生长因子组CK阳性,VIM阳性,而对照组CK阴性,VIM阳性.结论:胶原酶法能有效从早孕蜕膜组织中分离出子宫内膜间质干细胞,且子宫内膜间质干细胞能向子宫内膜上皮细胞分化.     

人与大鼠脂肪干细胞提取方法及生物学特性的比较研究

目的:研究人脂肪干细胞与大鼠脂肪干细胞的提取方法并对比差异,对培养出的细胞做形态学观察及表面标记鉴定.为今后ADSCs分化能力相关研究提供方法及依据.方法:获取人脂肪及大鼠脂肪,利用胶原酶消化法进行ADSCs提取,消化传代以纯化细胞.对比观察细胞形态,并取第3代的细胞进行细胞爬片HE染色、生长曲线测定、成脂和成骨诱导,流式鉴定表面标记物.结果:在相同的培养环境下,两种细胞均呈成纤维细胞样贴壁生长,h ADSCs原代第3天,r ADSCs原代第1天即可见较多细胞伸展为长梭形或短梭形,HE染色可见二者大小形态差异;成脂及成骨诱导组分别用油红"O"、茜素红染色为阳性,对照组为阴性.传代培养后,h ADSCs约1周,r ADSCs约6 d长满.流式鉴定示:二者均CD29(+),CD45(-),CD90(+),CD106(-),符合间充质干细胞特性.结论:本实验建立了高效提取ADSCs的方法,经过比较发现r ADSCs成骨能力较弱,在进行成骨向分化研究时不推荐首选;成脂能力与h ADSCs相似.r ADSCs是较好的动物来源脂肪干细胞,可广泛应用于再生医学研究.     

蒙古羊脂肪来源间充质干细胞的分离培养及体外分化诱导

建立蒙古羊脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem ceils,ADSCs）体外分离培养方法,并对其生物学特性和多向分化潜能进行鉴定。利用I型胶原酶将蒙古羊脂肪组织消化后,离心得到单核细胞,并进行传代培养,测定其倍增时间。采用甲苯胺蓝染色和PAS染色法以及RT-PCR法,分别从组织学水平和基因水平对第3代蒙古羊ADSCs向成神经和成心肌的诱导分化情况进行鉴定。结果显示,分离得到的脂肪间充质干细胞大小较为均匀,呈梭形或星形的成纤维细胞样;传代接种后第4天细胞进入指数生长期,第8天进入平台期,前10代ADSCs的倍增时间平均为34．1h;经成神经诱导后,细胞呈胶质细胞状,RT-PCR检测EN02和GFAP基因表达呈阳性;心肌诱导后,细胞体积增大,多呈长梭形,平行排列,诱导15d后部分细胞可见类肌管样结构,PAS染色可见明显的糖原沉积,RT-PCR检测NKX2．5和GATA-4基因表达呈阳性。表明获得的蒙古羊ADSCs具有多向分化潜能。     

鸡胚胎干细胞的分离、培养与鉴定的初步研究

采用饲养层培养法,以高糖DM EM为基础培养基,同时添加胎牛血清以及5 ng/m l SCF,l0 ng/m l bFGF和1 000 IU/m l mL IF等细胞因子与鸡胚浸出液等,对鸡的X期胚盘细胞进行离体培养,并利用形态学鉴定、AKP染色、体外分化实验等方法对所获得的细胞克隆进行鉴定。实验结果表明,本实验建立的培养体系培养出了具有多分化潜能的类胚胎干细胞。     

树鼩胸主动脉血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的 体外分离、培养树鼩(Tupaia belangeri)胸主动脉血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs),并对培养细胞进行初步鉴定, 为新型实验动物树鼩的应用研究提供体外模型。方法 无菌取幼龄树鼩胸主动脉,采用组织块培养法和胰蛋白酶、胶原酶连续消化法分别进行树鼩胸主动脉血管内皮细胞分离,经完全培养液培养,倒置显微镜观察细胞形态,并用抗Ⅷ因子抗体进行荧光染色鉴定细胞。结果 经组织块培养法分离培养的血管内皮细胞,3 d有细胞贴壁,7 d后细胞从组织块中大量长出,15 d汇合为单层;酶消化法所得细胞12 h即贴壁,3～7 d生长较快,12 d汇合成单层,镜下观察发现细胞呈典型的铺路石状;两种方法分离所得原代细胞经体外培养传代,6代内,细胞生长均良好;利用血管内皮细胞标志分子Ⅷ因子进行免疫荧光鉴定后确定为阳性。结论 本研究采用简便的方法成功分离到了树鼩胸主动脉血管内皮细胞,为血管内皮细胞相关研究提供了实验模型。     

大鼠骨髓基质干细胞分离培养及向成骨、成脂诱导分化的研究

目的利用细胞原代及传代培养技术将大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,为其进一步应用奠定基础.方法全骨髓法分离大鼠骨髓基质干细胞,传代后分别在成骨、成脂诱导条件下继续培养,采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色及油红"O"染色观察其成骨及成脂分化结果.结果第2代大鼠骨髓基质干细胞成骨诱导9 d后碱性磷酸酶染色呈阳性细胞,连续诱导14 d后可见矿化结节形成,成脂诱导14 d后可见脂肪细胞形成.结论随着诱导条件的不同,大鼠骨髓基质干细胞在体外可定向分化为成骨细胞和脂肪细胞.