酵母双杂交技术构建重组维甲酸X受体(RXR)基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组维甲酸X受体(RXR)基因酵母, 用以筛选具有类/抗维甲酸活性的化合物. 构建含有RXR基因的酵母表达质粒pGBT9-RXRβ, 称为诱饵质粒; 构建含有RXR协同激活因子GRIP1基因的酵母表达质粒, 形成靶质粒pGAD424-GRIP1; 诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187, 于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落, 构建RXR-GRIP1双杂交酵母. 考察RXRβ-GRIP1酵母与典型的RXR配体化合物天然激素-9-顺维甲酸的结合情况. 结果表明, 9-顺维甲酸能够诱导RXRβ-GRIP1酵母酶活性, 并存在显著的剂量-效应关系, EC₅₀值为1.5×10^-7 mol·L^-1. 构建的 RXRβ-GRIP1 酵母与报道的RXRβ- TIF2酵母相比, 对9-顺维甲酸的EC₅₀值接近, 但诱导活性较高. 进一步建立了检测环境污染物诱导/抑制RXRβ-GRIP1酵母β-半乳糖苷酶活性的实验方法, 用于检测三丁基锡乙酸盐化合物、Aroclor1254以及水厂进水和出水样品. 证明三丁基锡乙酸盐能够较强地诱导RXRβ-GRIP1酵母酶活性; 而Aroclor1254能够显著抑制9-顺维甲酸诱导的RXR酶活性, 是RXR拮抗剂; 水厂进水样品能够抑制9-顺维甲酸诱导的酶活性, 而现行工艺对RXR拮抗剂有很好的去除效果. 证实了该重组基因酵母用于环境污染物类/抗维甲酸干扰效应的筛选可行性.     

叶绿体ATP合酶CF_1与CF_0亚基间的相互作用

通过PCR的方法得到菠菜叶绿体ATP合酶9个亚基的编码序列, 分别克隆到质粒pGBT9和pGAD424, 双转化入酵母菌株HF7C和SFY526, 用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体ATP合酶各亚基间的相互作用. 同时用双杂交系统和体外结合实验检测 g 亚基与e亚基及e亚基突变体eDN21, eDC45之间的相互作用. 实验结果基本上支持目前关于细菌ATP合酶的结构模型. 与之不同的是, d 亚基与b, g, e 以及CF0的Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ亚基均有作用. 这些结果说明尽管叶绿体ATP合酶与细菌ATP合酶有着类似的亚基组成和空间结构, 但在亚基间的相互关系和催化过程中的构象变化上可能有所不同.     

叶绿体ATP合酶CF1与CF0亚基间的相互作用

通过PCR的方法得到波菜叶绿体ATP合酶9个亚基的编码序列,分别克隆到质粒pGBT9和pGAD424,双转化入酵母菌株HF7C和SFY526,用酵母双杂交系统检测菜叶绿体ATP合酶各亚基间的相互作用,同时用双杂交系统和体外结合实验检测γ亚基与ε亚基及ε亚基突变体ε△N21,ε△C45之间的相互作用,实验结果基本上支持目前关于细菌ATP合酶的结构模型,与之不同是,δ亚基与β,γ,ε以及CF0的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ亚基均有作用,这些说明尽管叶绿体ATP合酶与细菌ATP合酶有着类似的亚基组成和空间结构,但在亚基间的相互关系和催化过程中的构象变化上可能有所不同。     

水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定

以优良杂交水稻的恢复系明恢63为材料，构建覆盖水稻基因组的cDNA文库，用于功能基因组的研究。选择水稻全生育期过程的9个时期的不同组织和病原诱导的组织分别构建了15个定向cDNA文库。依据基因组DNA饱和杂交的原理，将从15个独立的cDNA文库中提取的质粒混合，并与固定有磁珠上具有互补性的2份基因组DNA亲和体系饱和杂交，收集杂交组分中的质粒并重新转化大肠杆菌，获得全生育期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.4kb，含62000个克隆子。反向Northem杂交显示，该文库收集了众多表达丰度极低的基因以及特异表达的基因。对文库中随机的10750个克隆进行了测序，序列分析比较后获得6399条非重复的EST(expressed sequence tag)序列，非重复序列占59.5％。目前，用该文库制作的cDNA芯片已被用于功能基因组的研究。     

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶基因克隆及在酒精酵母中的表达与分泌

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的葡萄糖淀粉酶是一种诱导的糖蛋白,它具α-1,4和α-1,6-D-glucan glucohydrolase活性,广泛用于需糖化淀粉的工艺.若将该酶基因导入啤酒酵母,构建能直接利用淀粉的酵母工程菌株,可省去淀粉液化和糖化的过程.国际上已有将泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶导入啤酒酵母的报道.该酶作用最适温度为60℃,对食用乙醇生产工艺较为有利.因此,我们用RT-PCR技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因,将其置于酵母烯酸酶(Enolase)启动子(Promotor)和终止子(Terminator)之间,构建了表达载体,转化非营养缺陷型酒精酵母AS.2.1364,获得能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株.1 材料与方法(1)菌种及培养基 泡盛曲霉(Aspeergillus awamori)NMRL3112,葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因供体,采用文献的培养基;酒精酵母(Sacchromyces cerevisiae)AS.2.1364为葡萄糖淀粉酶基因受体,采用YPD培养基;转化酵母采用YPDS培养基,含1%葡萄糖和1%可溶性淀粉.大肠杆菌TG1作为pAC1(由刘宏迪保存)及测序质粒pGEM-3zf( )的宿主菌,采用LB培养基,氨卞青霉素抗性.     

玉米Cat1基因顺式元件ABRE2结合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析

构建了授粉后17d(17dpp)的玉米幼胚cDNA基因文库，用玉米Catl基因顺式元件ABRE2通过酵母单杂交的方法筛选文库，获得3个完全相同的阳性克隆，命名为ABP9，用5′RACE的方法得到了该基因的全长cDNA序列，研究结果表明，ABP9属于bZIP类转录因子，与玉米Catl基因顺式元件ABRE2具有结合特异性，且在酵母细胞中具有转录激活功能。     

一个新的人类硫氧化还原蛋白基因的克隆

根据不同发育阶段 ( 1 3,33周 )的人胎脑组织mRNA差异显示分析 (又称DDRT PCR)所得到的具有差异表达的EST的序列 ,设计引物筛选点阵排列的人胎脑cDNA文库 ,得到一个新的全长cDNA克隆 .这个克隆全长 1 2 0 8bp ,包含一个 889bp的开放阅读框 ,一个 1 32bp的 5′非翻译序列和一个 2 0 9bp的 3′非翻译序列以及典型的polyA加尾信号 .其推断的氨基酸序列与人硫氧化还原蛋白同源 ,而且含有硫氧化还原蛋白的保守的活性位点序列 .将它命名为人的类硫氧化还原蛋白基因 (humanthioredoxinlikegene ,hTRXL) .     

优系青蒿法呢基焦磷酸合酶基因的克隆和酶学分析

从青蒿(Artemisia annua L)高产株系025的cDNA文库中克隆到了一个编码青蒿法呢基焦磷酸合酶(AaFPS1)的cDNA(af1). 序列分析表明, 这一cDNA编码一个含343个氨基酸残基的蛋白质, 分子量为39 kD. 推导出的氨基酸序列与来自其他植物、哺乳动物及酵母的FPS相似, 也包含异戊烯基转移酶和聚异戊烯基合酶所共有的5个保守域. 此cDNA在大肠杆菌中的表达产物表现出明显的FPS酶学活性. 通过离子交换层析纯化后, 进一步测定了其酶学动力学. 上述结果将进一步推动青蒿素生物合成分子调控的研究.     

用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子. 首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上, 构建成诱饵质粒pGBD-nifA, 接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1, pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上, 形成3个质粒文库YSPC1, YSPC2和YSPC3. 然后以pGBD-nifA为诱饵, 对YSPC1, YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选, 得到11个阳性克隆. DNA序列分析表明, 这11个阳性克隆分为4类, 包含4个1~1.3 kb不同的基因片段. 对这4个基因片段进行同源性比较发现, 其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域, 另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因, 另一个是未知蛋白. 将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体, 即互换换载体后, 它们仍然与NifA有相互作用; 对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用, 说明了它们与NifA相互作用的特异性.     

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨ＣＤ２分子的信号传递功能,以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈ４２１１－Ｇｌｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”,采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白ｃＤＮＡ序列,并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内ＣＤ２胞内区结合的特异性,克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胸内蛋白分子与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－ｌ）同源,Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体     

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨 ＣＤ２分子的信号传递功能，以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈｒ２１１－Ｇ１ｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”，采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白的ｃＤＮＡ序列．并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内与ＣＤ２胞内区结合的特异性．克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胞内蛋白分子，与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－１）同源 Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体转运蛋白质．蛋白数据库检索表明，Ｆｔｅ－１具有蛋白激酶ＰＫＣ的结合与作用位点，提示Ｆｔｅ－１参与ＣＤ２分子介导的信号传递     

6个植物MARs序列的ARS功能鉴定与分析

利用酵母表达系统, 对来自烟草和拟南芥的6个植物MARs序列分别进行了ARS功能鉴定. 结果表明, 在酵母细胞内, TM1和AM4有强的自主复制功能, 其活性与来自酵母染色体的ARS相当, 其他4个植物MARs序列无ARS活性. 为了进一步分析植物MAR序列中ARS的活性区, 利用PCR方法对TM1和AM4进行亚克隆, 相应的亚克隆分别命名为TM1-1, TM1-2, TM1-3, AM4-1, AM4-2和AM4-3. 实验发现, TM1-3和AM4-3不仅具有比完整MARs更高的ARS活性, 而且在酵母转化效率、转化稳定性及生长速度方面也优于完整片段. 本研究结果为阐明MAR的作用机制与自主复制功能的关系提供了重要线索.     

23种新的水稻boxC/D snoRNA的鉴定及功能分析

构建了一个水稻核内小分子RNA的cDNA文库, 经初步筛选获得30种boxC/D snoRNA. 与目前已鉴定的水稻snoRNA序列相比较, 除了U14等7种snoRNA 之外, 其余23种均为首次在水稻中发现. 在23种新的水稻boxC/D snoRNA中, 11种只存在于水稻中, 其余12种中, 6种为植物特有, 6种在酵母、动物和拟南芥中存在同源分子. 17种snoRNA指导了水稻5.8S, 18S和25S rRNA中24个2′-O-核糖甲基化修饰核苷, 其中19个靶位点的修饰已被证实. 6种新的水稻snoRNA不具有与rRNA互补的反义序列, 是一类新的snoRNA. 研究结果表明, 通过构建核内小分子RNA的cDNA文库可以有效地分离和鉴定水稻中新的snoRNA. 这些新发现的snoRNA对于阐明植物snoRNA基因组织和表达以及rRNA中2′-O-核糖甲基化修饰位点的产生机制具有重要意义.     

豌豆EF-1α的cDNA克隆、全序列及结构特征分析

以赤霉素 (GA)处理后的G2豌豆为材料 ,构建了一个 2 .0× 1 0 6的cDNA文库 ,用随机筛选法从该文库中得到一个 1 6 6 7bp的cDNA ,其 5′端非编码区长 1 0 0bp ,3′端非编码区长 2 2 3bp ,拥有一个 1 34 4bp的开放读码框 ,共编码 447个氨基酸 .DNA及报道的蛋白质序列同源性分析表明 ,它编码了豌豆延伸因子 1α(elongationfactor 1 alpha ,EF 1α) ,其功能区段具有很高的保守性 ,可应用于分子进化研究     

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶基因克隆及在酒精酵母中的表达与分泌

<正>泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的葡萄糖淀粉酶是一种诱导的糖蛋白,它具α-1,4和α-1,6-D-glucan glucohydrolase活性,广泛用于需糖化淀粉的工艺.若将该酶基因导入啤酒酵母,构建能直接利用淀粉的酵母工程菌株,可省去淀粉液化和糖化的过程.国际上已有将泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶导入啤酒酵母的报道.该酶作用最适温度为60℃,对食用乙醇生产工艺较为有利.因此,我们用RT-PCR技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因,将其置于酵母烯酸酶(Enolase)启动子(Promotor)和终止子(Terminator)之间,构建了表达载体,转化非营养缺陷型酒精酵母AS.2.1364,获得能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株.     

PRMT5通过抑制NF-κB削弱DR4介导的趋化因子CCL20释放

构建表达DR4的质粒pCMV-DR4-HA(DR4)和表达PRMT5的质粒pCMV- PRMT5-Flag, 共转染293T细胞, 验证DR4和PRMT5的相互作用. 将DR4和蛋白精氨酸N端甲基化转移酶5 (protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)两种质粒分别或者共转染293T细胞, 研究PRMT5对DR4引起的炎症因子释放的影响, 探讨PRMT5抑制DR4 (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor 1)引起炎症因子释放的分子机制. 分别通过RT-PCR和ELISA方法对炎症因子的表达进行定量检测. 通过双荧光报告基因方法检测PRMT5对DR4引起NF-κB活性变化的影响, 并且使用Western Blot方法检测ERK的表达变化. DR4和PRMT5在293T细胞中能相互结合, PRMT5过表达降低了DR4引起的NF-κB活性和ERK的磷酸化, 导致CCL20分泌减少. 因此, PRMT5在293T细胞中与DR4结合, 通过改变NF-κB和ERK激酶活性影响了CCL20的分泌, 参与了DR4介导的细胞免疫调节.     

两个东亚钳蝎毒素非编码转录本: 蝎毒腺细胞存在NMD途径的证据

从中国东亚钳蝎（Buthus martensii Karsch,BmK)毒腺组织cDNA文库中分离到两个毒素基因的非编码转录本,命名为BaαTX15-SP和BmTXKβ-SP。核苷酸序列分析表明它们的5’端序列分别与BmαTX15和BmTXKβ毒素cDNA的5’UTR和上游ORF序列一致,下游则缺乏任何同源性。两个非编码转录本含有多个短的ORF（≤34aa),3‘端含有一个AATAAA加尾信号,距poly(A)尾14－18nt。基因组织结构分析表明,两个非编码转录本并非错误剪接的产物。研究结果为蝎毒腺细胞可能存在类似于哺乳动物和酵母的无义介导的mRNA降解途径提供了证据。     

原子力显微镜(AFM)研究转录因子与DNA顺式

用原子力显微镜研究了转录因子ZmDREB1A与顺式作用元件DRE(脱水应答元件)的特异性相互作用. ZmDREB1A与核心序列为ACCGAC的DRE元件和核心序列为AGCCGCC的ERE元件(乙烯应答元件)间相互作用力的比较结果表明, ZmDREB1A能特异地结合DRE元件, 而与ERE元件间无特异性的相互作用. 另外, 通过泊松统计的方法计算出ZmDREB1A转录因子与DRE元件间的单分子相互作用力为99±9 pN. 研究结果表明, 原子力显微镜可作为一种灵敏、可靠的方法来研究转录因子与DNA顺式作用元件间特异性的相互作用力. 与传统的凝胶阻滞实验相比, 原子力显微镜在转录因子的功能分析上具有耗样量低、灵敏度高、无需放射性标记等优势.