重组人神经生长因子昆虫表达载体的构建及表达

目的:构建重组人神经生长因子(rh-NGF)杆状病毒表达载体,转染昆虫细胞从而获得目的蛋白的大量表达.方法:从人胎盘组织中提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增-NGF基因片段,经BamHI、HindⅢ双酶切后插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTM-Dual+[rh-NGF].对构建的载体进行PCR和酶切鉴定并测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA对rh-NGF的表达进行检测.结果:构建的rh-NGF基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA检测结果显示病毒感染的Sf9细胞可表达rh-NGF.结论:成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[rh-NGF],并在昆虫细胞系Sf9中得到表达,为大量制备重组人神经生长因子奠定了基础.     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

以提高乙肝病毒表面抗原表达量和免疫原性为目的的番茄果实特异表达载体的构建

为了提高乙肝病毒表面抗原基因在番茄果实中的表达量和免疫原性,采用克隆的E8番茄果实特异表达启动子和乙肝病毒表面抗原M蛋白基因构建了植物表达载体pBIES2, 及只含有乙肝病毒表面抗原S蛋白的表达载体pBIES,并将它们分别导入根癌农杆菌LBA4404中.最后对该载体的优越性进行了讨论.     

腺病毒介导的DPP6过表达载体的构建及其在大鼠心肌细胞内表达的鉴定

目的:构建腺病毒介导的DPP6过表达载体并验证其在大鼠心肌细胞内的表达.方法:应用PCR技术扩增目的基因DPP6,经酶切、连接等反应将目的基因插入穿梭载体p Shuttle-CMV中,进而转化至含有Ad Easy质粒的大肠杆菌中,进行重组;所产生的腺病毒载体转染在HEK-293细胞中,进行腺病毒的包装、分泌和扩增,所得病毒感染大鼠心肌细胞,进行荧光及实时定量PCR(q PCR)鉴定.结果:DPP6过表达腺病毒载体构建成功,经HEK293细胞包装、扩增后,所得病毒可成功感染初生大鼠心肌细胞,观测到腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达,q PCR检测DPP6 mRNA表达明显升高.结论:成功构建了腺病毒介导的DPP6过表达载体,并在大鼠心肌细胞内成功表达,为进一步研究DPP6在心肌细胞内的功能奠定了基础.     

EGFR基因C端结构域真核表达载体的构建

构建EGFR基因C端结构域的真核表达载体.应用PCR技术,从含EGFR基因C端结构域的大肠杆菌DH 5α中扩增其序列,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,经酶切及测序进行验证.PCR扩增片段与预期结果相符,真核表达载体构建成功,测序结果与GenBank公布的基因一致.成功地构建了EGFR基因C端两个结构域的真核表达载体.     

胰腺特异性表达Hes1基因的构建及体外表达

为了探究胰腺的发育机制,以及制备胰腺缺陷型的小型猪模型,构建了特异性表达载体,开展了相关载体构建及体外验证研究.本研究以小鼠PDX1启动子为特异性启动元件,构建胰腺特异性启动小鼠Hes1基因的表达载体PDX1-Hes1,载体转染MIN-6胰岛β细胞、猪耳成纤维细胞及猪肾细胞,培养48h后,通过qRT-PCR、Western Blot检测.结果显示:Hes1在MIN-6胰岛β细胞中的RNA水平和蛋白水平均高效表达,而在非胰腺细胞猪耳成纤维细胞及猪肾细胞中均不表达.试验表明:胰岛特异性表达载体PDX1-Hes1的成功获得,为构建相关基因在胰腺中特异性表达的载体提供参考,为后续制备胰腺缺陷型的小型猪提供了条件.     

人白血病抑制因子真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用RT-PCR方法从人子宫内膜组织总RNA扩增出hLIF的全长基因,然后将其克隆至pcDNA3上,成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/hLIF.利用脂质体介导将这一表达载体导入COS-7细胞和CHO-K1细胞,分别获得了hLIF的瞬时表达和稳定表达,为进一步进行hLIF生物学功能研究和hLIF在哺乳动物细胞中的高表达研究奠定了基础.     

Abd-Bcr/Abl原核表达载体的构建和表达

构建Bcr/Abl-Abd原核表达载体,并表达、观察对白血病细胞K562的影响.以慢性白血病PGD210质粒为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增出Abd编码区序列,克隆入pMD18t载体,经酶切测序鉴定正确.再通过酶切重组克隆入原核表达载体pET32a,构建pET32a-Abd重组表达质粒,经酶切、测序鉴定,序列、读码框均正确.通过转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,纯化.结果PCR扩增出特异性的501bp的目的片断,以此构建的重组质粒pET32a-Abd能够在上清中表达约36.6 kd的目的蛋白,Westem blot鉴定为特异表达.证明成功构建了原核表达载体pE732a-Abd,并表达在上清中,表达蛋白约占菌体总蛋白的6%,纯化后达到74.3%,Westem blot检测为特异性表达,为进一步研究该蛋白对慢性白血病细胞的作用奠定了分子基础.     

TBSV病毒瞬时表达载体构建及其表达

为了深入理解植物RNA病毒载体表达系统,初步建立了利用TBSV病毒表达载体在寄主植物烟草中表达外源蛋白的技术体系.以番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)为材料,构建了含报告基因sGFP的WY1,WY2等2个重组病毒表达载体,并将载体导入农杆菌GV3101用于侵染烟草植株叶片;利用农...     

重组表达载体pGEM-VLA4的构建

从人外周血细胞中提取mRNA,用RT-PCR法扩增含BamH与HindⅢ酶切位点VLA4基因序列,运用分子生物学方法将该序列克隆到pGEM中,构建成VLA4基因序列的真核表达载体并进行鉴定分析.对重组载体用双酶切系统酶切后进行电泳并测序,结果证明目的基因克隆及连接方向正确,测序结果正确.通过实验,成功地构建了含VLA4基因的真核表达载体pGEM-VLA4.     

融合聚精氨酸九肽的小热休克蛋白 原核表达及蛋白纯化

目的构建小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,表达纯化融合蛋白.方法在小热休克蛋白表达载体的基础上利用点突变方法引入聚精氨酸九肽对应序列,转入BL21大肠杆菌感受态细胞进行原核表达,利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化.结果成功构建了融合聚精氨酸九肽的HSP16. 5融合蛋白表达载体,并对其在大肠杆菌细胞中的原核表达进行条件优化,研究显示:在诱导剂IPTG浓度为0. 5 mmol、37℃条件下诱导4 h目的蛋白产量较高.结论此实验成功构建了小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,得到了高纯度的小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础.     

neuritin基因杆状病毒表达载体的构建

为研究Neuritin蛋白的功能,将neuritinORF在杆状病毒-昆虫表达系统中表达,构建杆状病毒表达载体.以308D10为模板,利用PCR方法扩增neuritinORF,定向克隆法将其克隆至PFASTBAC-HTA转移载体中.然后利用同源重组原理将其转移至杆粒bacmid中.得到携带neuritin ORF的重组杆粒.本实验获得了重组目的基因真核表达载体并经PCR鉴定,插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符,成功构建了Neuritin的杆状病毒表达载体.     

结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达质粒的构建及表达

构建结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达载体.PCR扩增Rv2450基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1（-）,重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pCDNA-Rv2450,RT-PCR结果证明Rv2450可在P815细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有Rv2450蛋白的细胞着染.成功构建了结核分枝杆菌Rv2450基因的真核表达载体pCDNA-Rv2450,Rv2450基因可以在P815细胞中表达.     

rPA(K)的定点突变及其真核表达载体在COS-7细胞中的瞬时表达

采用定点突变技术,对真核表达载体pCSRK上的目的片段rPA(K)进行突变,获得了含有突变体rPA(KN)(N184→Q)的真核表达载体pCSRKN.酶切和测序结果证明,成功去除了184位的糖基化位点.用LipofectamineTM2000 Reagent将pCSRKN转染至COS-7细胞,取转染后不同培养时间上清,以FAPA法进行检测.结果表明,表达产物具有良好的溶圈活性,从而验证了pCSRKN在真核系统表达的可行性.     

HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体的构建及其在HepG2中的瞬时表达

通过PCR法扩增出HCV包膜糖蛋白E1-E2的全长基因片段.将测序正确的片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体.再采用脂质体法转染肝癌细胞系hepG2,利用RT - PCR、Western blot等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定.结果表明所构建的含有HCV包膜糖蛋白E1-E2基因的真核表达载体在HepG2细胞中能瞬时表达.重组真核质粒的构建及表达为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定了基础.     

人膜蛋白CD81的原核表达与纯化

以高效原核表达载体pCold TF为载体骨架,应用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法,将pCold TF中的六聚组氨酸(His-Tag)序列替换为限制性酶切位点SpeⅠ序列ACTAGT,构建不含His-Tag序列的新载体pL118.以此载体表达蛋白时,通过PCR引物在目的基因3′端添加His-Tag以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的Trigger Fac-tor(TF)助溶蛋白的去除.应用pL118对人膜蛋白CD81进行原核表达与纯化,并使用Fac-tor Xa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白,获得3′端含有His-Tag的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化,为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81的功能奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.     

exendin-4表达载体构建及其在大肠杆菌中分泌表达

目的:研究新型抗糖尿病药物exendin-4的分子作用机制,为exendin-4的大规模生产奠定基础.方法:采用重叠PCR法扩增出exendin-4的完整序列,并将其克隆至表达载体pET22b上,得到重组质粒pET-Exn4.重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,超声破碎表达产物,Tricine-SDS-PAGE分析exendin-4表达.结果:PCR、酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pET-Exn4,Tricine-SDS-PAGE结果表明ex-endin-4基因在大肠杆菌中获得了分泌表达.结论:成功构建了exendin-4的重组表达载体并在大肠杆菌中实现分泌表达.     

CUEDC2突变体的构建及在原核和昆虫表达系统中的表达

目的：构建CUEDC2的突变体并在原核和昆虫表达系统中表达验证。方法：根据人cuedc2序列设计引物,以其突变体质粒为模板PCR扩增目的片段,酶切后连接至pET28a原核表达载体以及pFastBac1-Flag-N和pFastBac-HTA昆虫表达系统的表达载体,转化至DH5α后提取质粒,经菌液PCR、测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)及DH10Bac感受态细胞中。原核表达载体在E.coli中表达后用Ni-NTA亲和纯化,SDS-PAGE检测。昆虫表达载体提取杆粒,转染至昆虫细胞Sf9中表达,最后用western 进行鉴定。结果：成功构建了CUEDC2的突变体,并在原核和昆虫表达系统中表达。结论：在原核和昆虫表达系统中,成功表达的CUEDC2突变体蛋白为CUEDC2的结构和功能研究奠定了基础。     

GGT1基因的真核表达载体构建及其表达定位

构建GGT1重组真核表达载体,观察GGT1在COS7细胞中的定位.利用PCR技术扩增GGT1全长基因,经HindⅢ和EcoR Ⅰ酶切后连接入pEGFP-N1真核表达载体.将构建完成的重组表达质粒转染入COS7细胞,利用激光共聚焦显微镜观察GGT1在细胞中的定位.构建载体经双酶切和序列测定证实重组载体包含有正确的GGT1编码序列.激光共聚焦显微镜观察到,整个细胞内弥散绿色荧光,绿色荧光分布于COS7细胞浆中,提示GGT1定位于细胞浆中.成功构建人pEGFP-N1-GGT1真核表达载体,检测到GGT1定位于哺乳细胞的细胞浆中,为GGT1的功能研究提供了线索.