BMP7基因真核表达载体的构建及荷瘤小鼠制备

目的克隆BMP7基因及构建BMP7基因真核表达载体,稳定转染于H22细胞系,制备荷瘤小鼠。方法应用RT-PCR技术从人胚肾细胞系293T细胞总RNA中成功扩增出1 293 bp包含BMP7基因编码区的cDNA序列,在上下游加上BamHI及HindⅢ双酶切位点后形成带酶切位点的BMP7基因,然后连入含BaraH I及HindⅢ双酶切位点的pEGFP-C1表达质粒上,构建BMP7基因的重组真核表达质粒pEGFP-C1-BMP7。脂质体介导方法转染细胞,RT-PCR、western-blot方法检测其mRNA及蛋白表达,皮下注射制备荷瘤小鼠。结果扩增的cDNA经测序比较与基因文库完全一致;BamHI及HindⅢ双酶切后,质粒形成约4.7 kb和约1.3 kb两条带,与理论计算值完全一致。注射转染BMP7基因后H22细胞小鼠瘤体明显增大。结论成功克隆BMP7基因及构建BMP7基因的真核表达载体。BMP7基因高表达可能是细胞癌变的原因之一。     

DLL1-ICD基因真核表达载体的构建及转染鉴定

通过克隆DLL1-ICD(Delta-like1细胞内区域)的cDNA及测序鉴定,构建pEGFP-C1-DLL-ICD真核表达载体并进行细胞转染,为研究Notch信号通路与Neuritin的关系奠定基础。首先根据小鼠全长DLL1 cDNA序列,设计DLL-ICD PCR引物,以小鼠胎脑cDNA文库为模板,利用PCR技术扩增DLL1-ICD cDNA。将扩增出的基因片段克隆至pEGFP-C1载体,进行DNA序列测定。并进一步将测序正确的pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体转染HEK293细胞。结果显示:成功克隆了DLL1-ICD的cDNA片段,测序结果与基因文库中的DLL1-ICD序列一致,并在转染真核细胞后获得了较好地表达。表明pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体构建成功,并在293细胞中成功表达了DLL1-ICD-EGFP融合蛋白。研究结果为进一步探讨Notch信号通路与神经系统疾病的分子机制奠定基础。     

副粘病毒Tianjin株F基因真核表达载体的构建及初步鉴定

为研究仙台病毒主要表面抗原f蛋白对小鼠的免疫效果,应用RT-PCR从副粘病毒Tianjin株基因组中扩增出F基因,将其插入pcDNA3的Pcmv下游,构建了F基因真核表达载体,同时使用PCR、限制性酶切和测序等方法对其进行了鉴定,鉴定结果证实构建成功.构建好的F基因真核表达载体可为下一步的体外表达和动物免疫实验奠定基础.     

全长人lrp基因及其截短和定点突变体真核表达载体的构建

为了对脂多糖应答基因（lrp）的功能进行深入的研究,实验用PCR及双PCR法扩增出lrp基因的截短体（lrp△C）和突变体（lrpm）序列,测序正确后将正常lrp基因及其截短体和突变体序列均连入真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-lrp、pcDNA3．1（＋）-lrp△C和pcDNA3．1（＋）-lrpm。DNA测序结果显示,PCR反应成功得到了lrp基因的截短体和突变体序列;重组质粒酶切鉴定结果显示：人lrp基因及其截短体、突变体成功连入了真核表达载体pcDNA3．1（＋）。     

EGFR基因C端结构域真核表达载体的构建

构建EGFR基因C端结构域的真核表达载体.应用PCR技术,从含EGFR基因C端结构域的大肠杆菌DH 5α中扩增其序列,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,经酶切及测序进行验证.PCR扩增片段与预期结果相符,真核表达载体构建成功,测序结果与GenBank公布的基因一致.成功地构建了EGFR基因C端两个结构域的真核表达载体.     

人核呼吸因子2基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建人核呼吸因子2(NRF2-α和NRF2-β)的真核表达载体,并检测其在瞬时转染的人肝癌BEL-7402细胞株的表达水平。方法:根据NCBI数据库中NRF2-α和NRF2-β的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增目的基因并构建带FLAG标签的真核表达载体,瞬时转染BEL-7402细胞后,分别使用半定量RT-PCR技术和Western blot技术检测其mRNA和蛋白质表达水平。结果:通过酶切鉴定和DNA序列分析,证实已成功构建了人NRF2-α和NRF2-β的真核表达载体,并能在瞬时转染的人肝癌BEL-7402细胞中实现基因的过表达。结论:成功构建了人NRF2-α和NRF2-β的真核表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

人Kai-1基因真核表达载体的构建及其体外表达

克隆人Kai-1基因,构建其真核表达载体,并在体外细胞系中进行表达验证。提取人正常肝细胞系HL7702的总RNA,通过RT-PCR其反转录为c DNA;以该c DNA为模板,通过PCR扩增出Kai-1基因的编码区,将该目的片段纯化后亚克隆入真核表达载体pc DNA3.1myc-his(-)中,利用菌落PCR及DNA测序分别对Kai-1基因编码区的大小及序列进行鉴定。将所构建的重组质粒通过脂质体瞬时转染Hela细胞,48 h后裂解细胞,利用Western blot检测有无目的蛋白的表达。测序证实所克隆的Kai-1编码区c DNA正确地插入pc DNA3.1myc-his(-)中,经Western blot检测证实其在Hela细胞中得到表达。成功克隆了人Kai-1 c DNA,构建了其真核表达载体,并在Hela细胞中得到有效表达,为进一步研究Kai-1的功能奠定了基础。     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

MTERF1基因真核表达载体的构建及其在C-33A细胞中的表达研究

采用PCR技术从pGEM-MTERF1重组克隆载体中扩增出人MTERF1基因cDNA的开放阅读框序列,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后,以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1;通过PCR、双酶切和DNA测序方法对重组子进行鉴定;将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1转染C-33A细胞,利用免疫印迹法检测MTERF1蛋白的表达。结果显示,重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1经双酶切鉴定和菌落PCR鉴定均获得大小为1 200 bp的目的条带,DNA测序结果表明该序列与GenBank中人MTERF1基因序列完全相同,插入基因的大小和方向正确;免疫印迹结果表明,MTERF1蛋白的表达水平在转染pcDNA3.1(+)-MTERF1的C-33A细胞中表达高于转染pcDNA3.1(+)的C-33A细胞。通过对人MTERF1基因的真核表达载体的构建,为进一步研究人MTERF1基因的功能奠定了基础。     

人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建

从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。     

乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建

报道了将乙型肝炎病毒（ａｄｗ亚型）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因和ＨＢＡｇ及其前导序列（ＨＢｓＡｇ＋ｐｒｅＳ２）基因分别插入植物表达载体ｐＲｏＫⅡ的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子下游,构建为重组质粒ｐＲＨＢ和ｐＲＰ,并将其分别导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中。     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

neuritin基因杆状病毒表达载体的构建

为研究Neuritin蛋白的功能,将neuritinORF在杆状病毒-昆虫表达系统中表达,构建杆状病毒表达载体.以308D10为模板,利用PCR方法扩增neuritinORF,定向克隆法将其克隆至PFASTBAC-HTA转移载体中.然后利用同源重组原理将其转移至杆粒bacmid中.得到携带neuritin ORF的重组杆粒.本实验获得了重组目的基因真核表达载体并经PCR鉴定,插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符,成功构建了Neuritin的杆状病毒表达载体.     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1.PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列.并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中.因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达.     

人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建

目的:为研究细胞周期蛋白在肿瘤形成过程的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白E的真核表达载体,并检测其在瞬时转染HeLa细胞株中的蛋白表达。方法:通过RT-PCR扩增cyclinE基因编码cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMVTM-14真核表达载体,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测其在HeLa细胞中融合蛋白的表达。结果:经酶切鉴定和测序分析证实人cyclin E的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达。结论:成功构建了人cyclin E的真核表达载体,为进一步研究细胞周期蛋白的功能奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建

构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3．1( )-EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记．     

以提高乙肝病毒表面抗原表达量和免疫原性为目的的番茄果实特异表达载体的构建

为了提高乙肝病毒表面抗原基因在番茄果实中的表达量和免疫原性,采用克隆的E8番茄果实特异表达启动子和乙肝病毒表面抗原M蛋白基因构建了植物表达载体pBIES2, 及只含有乙肝病毒表面抗原S蛋白的表达载体pBIES,并将它们分别导入根癌农杆菌LBA4404中.最后对该载体的优越性进行了讨论.     

HPV16 E6基因真核表达载体的构建

本研究目的是构建HPV16 E6真核表达载体,为细胞转染研究E6蛋白和p53Arg或p53Pro蛋白的相互作用以及作用后对细胞功能的影响奠定基础。应用PCR技术从质粒pSP64-HPV16 E6上扩增出HPV16 E6片断。根据Kozak序列对真核蛋白表达的影响,设计2条引物扩增出2个HPV16 E6目的片断均插入真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A中,构建pcDNA3．1／myc-His（-）A．HPV16 E6重组质粒。研究结果显示：经酶切和测序鉴定克隆的基因片段为HPV16 E6 cDNA;建立了pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6重组质粒。这表明,已成功构建HPV16 E6真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6。