水稻精细胞基因RSSG58启动子的克隆分析及表达载体构建

根据分布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基因cDNA序列，以水稻品种“桂朝2号”黄化苗组DNA为模板，用PCR方法克隆出RSSG58在起始密码子以前的上游调控序列Pr58，经过Pr58启动子进行的鉴定和分析表明，具备大多数高等植物启动子的保守元件，预计它的RSSG58基因在特异表达方面具有一定的作用。为了鉴定RSSG58基因的基本启动子元件，将RSSG58基因5′侧翼序列做缺失片段分析，由PCR从Pr58中得以3个不同大小两端带有HindⅢ，BamHⅠ酶切位点的片段Pr58Ⅰ，Pr58Ⅱ和Pr58Ⅲ，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP）中，取代原有的CaMV35S启动子，构建了由驱动报造基因GFP的植物表达载体pRGFPⅠ，pRGFPⅡ和pRGFPⅢ，用于农杆菌介导法水稻遗传转化。其目的是为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定基础。     

绿色荧光蛋白(GFP)基因在短小芽孢杆菌中的组成型表达

采用PCR技术,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组中的启动子活性片段F1,构建了一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-F1gfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,检测了该片段在短小芽孢杆菌DX01菌株中的启动活性,在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证实活性片段F1具有组成型启动子的功能,GFP基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达．     

GATA-3启动子报告基因载体构建及其活性鉴定

目的转录因子GATA-3在人乳腺癌的发生发展中扮演重要的角色,研究其转录调控有重要意义.方法从人乳腺癌细胞系MCF-7提取基因组DNA为模板,以PCR方法扩增获得GATA-3启动子序列,将片段克隆到pGL3-Basic载体内,鉴定后通过报告基因检测系统检测GATA-3启动子报告基因的荧光素酶活性.结果双酶切、基因测序鉴定结果显示,成功构建了GATA-3启动子报告基因,并在MCF-7细胞内鉴定了其具有荧光素酶的表达活性.结论本实验成功构建了GATA-3启动子报告基因载体pGL3-GATA-3pro-Luc,为后续GATA-3在乳腺癌中表达及其调控通路以及以GATA-3为靶标的抗肿瘤药物研究提供了有效工具.     

水稻花粉特异性启动子的克隆与表达

利用PCR技术,从水稻幼苗总DNA中扩增并克隆了一段DNA片段。将该片段与报告基因GUS基因融合,构成植物表达载体。经农杆菌转化烟草萌发花粉,共培养约24h后,作瞬时表达检测。结果表明,该克隆片段具有启动子功能。DNA序列分析表明,该克隆片段长度为526bp,含有TATA盒及CAAT盒。与原基因（PSI）启动子序列比较,同源性为52％。部分顺式调控元件相同。     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

人NLK上游启动子区的克隆与鉴定

初步鉴定并分析NLK上游启动子,为研究其转录调控打下基础。对NLK基因翻译起始位点上游约1 958 bp的序列分别进行生物信息学分析,以PCR技术扩增以上序列并测序。将PCR所得到的NLK上游片段进一步克隆到PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒PGL-3basic-luc。通过荧光素酶报告基因实验检测上述启动子的活性。成功构建了包含NLK基因上游启动子序列的荧光报告系统,经荧光素酶报告基因实验证明该重组质粒体具有转录活性。构建的NLK基因上游启动子报告基因载体为进一步研究NLK基因的转录调控机制奠定了基础。     

人MTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

人MTERF3基因编码线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子。采用PCR技术对人MTERF3基因5'侧翼上游1251 bp启动子序列进行扩增,并将其克隆至荧光素酶表达载体p GL6-TA,构建人MTERF3基因启动子荧光素酶报告基因质粒。经酶切、测序鉴定后,将其用脂质体转染体外培养的HEK293细胞株,利用双荧光素酶测定系统检测其表达活性。研究结果表明,克隆获得的1251 bp DNA序列与Gen Bank报道的一致,且插入方向正确。含人MTERF3基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高(P0.05),约为对照组(空载体p GL6-TA)的9.8倍。本研究通过对人MTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶表达载体构建与表达活性的测定,为进一步阐明人MTERF3基因表达的调控机制奠定实验基础。     

菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体构建及原核表达

分析菠菜叶绿体基因组全序列,选用了rbcL基因和accD基因的间隔区作为外源基因的定点整合位点,并从菠菜叶绿体基因组中克隆了rbcL基因全长和accD基因的5′端部分,长度分别为1956 bp和1320 bp。以这2个DNA片段作为同源重组片段,以烟草叶绿体基因的启动子Prrn和终止子psbA3′控制外源基因的转录,构建了包含筛选标记基因aadA基因(编码氨基糖苷-3′-腺苷酸转移酶,具有壮观霉素和链霉素抗性)和报告基因GFP(编码绿色荧光蛋白)的菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGA。酶切结果显示构建正确。将该载体转化大肠杆菌,在激光扫描共聚焦显微镜下用488 nm蓝光激发,发现大肠杆菌发出强烈的绿色荧光,而对照菌体没有荧光,表明GFP基因在原核大肠杆菌中已经成功表达。实验结果说明构建的菠菜叶绿体定点整合表达载体pRAGA可以用于菠菜叶绿体转化。     

苦瓜McAG2启动子的克隆与表达研究

文中从苦瓜基因组中克隆得到长为1417 bp的McAG2基因5′上游片段并进行了DNA序列分析.通过PCR得到了其缺失片段,将其插入pBI121载体替换CaMV35S启动子,得到了McAG2基因5′侧翼缺失表达载体.并利用农杆菌介导转化烟草,建立了相应的转基因烟草植株,以研究其在不同器官组织中的表达特性. β-glucuronidase(GUS)染色结果显示该启动子在转基因烟草叶片和根组织中没有表达活性.     

粪肠球菌中具有启动功能的DNA片段的捕获及鉴定

PCR扩增来自质粒pUC119的β-内酰胺酶基因(bla)作报告基因,克隆进质粒pNZ8037上的能被Nisin诱导的启动子PnisA下游,构建了粪肠球菌启动功能片段探测载体pNZ-bla.利用该探测载体从粪肠球菌染色体总DNA中克隆到了能在粪肠球菌中表达的一系列具有启动功能的DNA片段,将包含克隆片段的pNZ-P-bla6质粒电击转化粪肠球菌,培养转化子并检测其抗氨苄强度,结果表明其抗氨苄强度大于Nisin诱导的含pNZ-bla质粒的粪肠球菌.表明克隆的功能片段启动能力强于PnisA.在pNZ-P-bla6的启动功能片段下游Sau3AⅠ和EcoRⅠ之间接上绿色荧光蛋白基因作为标记,构建表达绿色荧光蛋白的质粒载体pNZ-P-gfp并导入粪肠球菌中,共聚焦显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白的表达.     

“巂”“雋”形音义考辨

＂巂＂＂雋＂二字字形相近,但两个字形又是记录汉语中不同音义结合的词语;在古代文献中,＂巂＂＂雋＂两形体产生混用问题。利用传统语言文字学的知识,对这两个字的形、音、义进行考辨,得出＂巂＂＂雋＂二字因为在楷书阶段形体相近,造成音义的转移。传世文献中存在的错误应当得到纠正。     

心与"新"的碰撞——论知识经济条件下的大学生心理健康教育

知识经济对大学生心理健康教育提出了严峻挑战,优化大学生心理素质显得尤为重要和紧迫。为此,高校应着力在强化心理健康知识,丰富健康活动;造就可持续发展的师资队伍;构建多向互动、效果持续的心理健康教育新模式以及注重大学生创新心理素质培养等方面加大教育力度。     

“不”和“没”的分布差异探讨

“不”和“没”是言语表达中出现频率很高的两个词,二者表意基本相同,使用环境也非常相似,然而在语言的比较教学过程中,更多凸现出来的却是二者混用带来的表意不清。从语义、语法、语用三个角度看,Z-者在语义指向上所呈现出的主客观的差异与所在语句的时范畴、否定对象的不同有直接关系,而在语用上显现的差异相对较小。     

“能”和“可以”的辨析

本文对“能”和“可以”的一些问题进行了探讨。探讨中得出在语义上“能”主要表示有能力,“可以”主要表示可能性。针对于一些学者认为的“能”和“可以”的义项与人称主语和疑问语气有密切关系的论断持不同的态度,经过分析得出两者义项的选择与语境的关系最为密切;本文还把“能”和“可以”的肯定与否定的不对称现象用表格的形式,清楚地列了出来;对“不可以”的扩大使用的现象通过语料库得出它使用的范围比较窄;最后,从语义、语法、语用三个方面对“能”和“可以”进行了辨析,希望对对外汉语教学有一定的作用。     

直觉模糊逻辑"与"、"或"算子的研究

在直觉模糊集定义及模糊逻辑“与”、“或”算子的基础上 ,利用 F -格的序关系 ,研究了直觉模糊逻辑“与”、“或”算子 .给出了直觉模糊逻辑 t-范及 t-余范的定义 ,同时给出了两种新型直觉模糊逻辑“与”、“或”算子 ,探讨了直觉模糊逻辑“与”、“或”算子的 t-范及 t-余范所具有的性质 .拓广了模糊逻辑中关于生成子的概念 ,给出了阿基米德直觉t-范及 t-余范的表现定理 ,并对不同算子分别进行了研究 .     

“一点儿”和“有点儿”小议

“一点儿”和“有点儿”是意义相近但用法有所不同的一组词。前贤对它们的联系与区别作过研究,本文用大量例句结合现代理论对“一点儿”只能修饰动词或形容词的否定式的原因加以解释,并对“有点儿”在修饰动词或形容词的否定式时只能用否定词“不”而不能用“没”的原因加以解释。     

《文选》与《玉台新咏》

南朝梁时，萧统、萧纲兄弟分别主持编纂了《选》和《玉台新咏》。论对其编撰目的和体例、作家作品录情况、各自的学观和对后世的影响，一一进行了比较研究，从而见出它们的价值与得失。     

"象"的境界与"数"的真理--作为中西古典美学意义之发端的老子"象论" 与毕达哥拉斯学派的"数论"

老子“象论”与毕达哥拉斯学派“数论”分别构成了中西古典美学的意义之发端。两在思想路向上存在着巨大的差异。老子“象论”及其人生论的思想路向启发了中国古典美学中的“意象”本体论和以“境界”为最高审美理想的思想;毕达哥拉斯学派“数论”及其知识论的思想路向启发了西方古典美学中的“形式”本体论和以“真理”为最高审美理想的思想。     

“天道”与“人文”

对中国古代化的研究，应注重古人对“天道”与“人”关系的认识，本举物质、制度、学等三事以证中国古代人本于天道的民族传统及其影响，并从多方面相互印证说明中国古代“拟天道以成人”是一个悠久的无所不在的传统，从而全面把握华夏化的根本及其成因；由此出发，才可能总结出中国特色的人科学理论。     

朱子之“理”的天道自然观基础及其理气二元结构

朱子理学有着十分深厚的天道自然观基础,他成功地将天道自然观转换为天理自然观;“气化流行”是这一转换中的关键范畴,其思维取向是道体（理）自然而成化。朱子的“天理”观,显示了从天道自然到理所当然的人文道德之价值维度。朱子天理观中的理气二元结构存在着难以解决的理想与现实之间的矛盾,这导致他偏轻偏重地言理言气,而太极范畴的推出,依然没有解决这一矛盾。