利用高效液相色谱检测发酵液中S-腺苷蛋氨酸含量

建立了利用Waters2695高效液相色谱测定毕赤酵母发酵液中S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethi-onine,SAM)含量的方法,对HPLC-UV法检测SAM含量的色谱条件进行优化,最佳色谱条件如下:All-tima C18柱,150 mm×4.6 mm,5μm,流动相为V(0.01 mmol/L甲酸铵)∶V(甲醇)=97∶3,流速0.6 mL/min,柱温30℃,检测波长260 nm.优化后的色谱分离条件可使样品中的SAM与杂质达到较佳分离,稳定性、精密度及重复性都较好,其RSD均小于1.5%.利用SAM标品制作标准曲线Y=32408606.0721 X+130181.2824,线性范围为0.012～1.2 g/L,R2达到0.9998,平均回收率为100.027%～102.533%.此方法可有效地检测发醇液中S-腺苷蛋氨酸含量.     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可溶性表达

系统考察了pET可溶性表达系统对酵母来源的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的表达情况,结果显示:当采用含Nus.Tag融合标签的pET-44a为载体,trxB和gor双突变的Ori-gami为宿主时最适合目的蛋白的可溶性表达。进一步考察不同来源(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)SAM合成酶的可溶性时,也得到了相似的结论;比较发现酵母来源的SAM合成酶可溶性表达的比活力最高达60.9U/mg。     

S-腺苷蛋氨酸和苏氨酸对红霉素发酵产量及组分的影响

研究了在红霉素发酵培养基中添加不同的氨基酸和不同的氨基酸组合对红霉素发酵产量及组分的影响.经3 L自动发酵罐培养考查表明,添加0.4 g/L的S-腺苷蛋氨酸和0.3 g/L的苏氨酸,使红霉素的发酵单位和红霉素A含量分别提高了8.3%和13.1%,红霉素B和红霉素C的含量分别降低了49.5%和40.2%,产品质量完全符合2010版中国药典的要求.     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可溶性表达

系统考察了pET可溶性表达系统对酵母来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达情况,结果显示:采用含Nus·Tag融合标签的pET-44a为载体,trx B和gor双突变的Origami为宿主最适合目的蛋白的可溶性表达。进一步考察不同来源的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的可溶性时,也得到了相似的结论,比较发现酵母来源的SAM合成酶可溶性表达的比活力最高达60.9 U/mg。     

复合诱变和原生质体融合选育S-腺苷甲硫氨酸酿酒酵母高产菌株

对生产S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的酿酒酵母（S.cerevisiae）菌株R1进行复合诱变和原生质体融合。采用酶解法获得出发菌株S.cerevisiae R1的单倍体菌株hR10,对其进行UV和DES复合诱变,筛选出了4个单倍体正突变株DR1-3、NM14、NM39和NM45。制备了单倍体正突变株的原生质体,采用热灭活和UV灭活法灭活双亲原生质体,在聚乙二醇（PEG）的诱导下进行原生质体融合,筛选得到融合子F35,其生产 SAM的产量为22.5 mg/L,与出发菌株R1（11.1 mg/L）相比,提高了103%,并且能够稳定遗传。采用正交试验优化了F35发酵生产SAM的培养基和发酵时间,优化了的培养基配方为麦芽糖100 g/L,蛋白胨10 g/L,NH₄H₂PO₄4g/L,NH₄Cl₅g/L,MgSO₄0.1g/L,KH₂PO₄6 g/L,发酵时间为72h。     

SAM合成酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

采用PCR技术从S.cerevisiae TCCC 31012菌株的染色体DNA中扩增得到S-腺苷甲硫氨酸合成酶-2基因(sam2),将sam2克隆到酿酒酵母表达载体pACT2的强启动子PADHI控制下,以构建高效表达质粒,并在酿酒酵母亮氨酸缺陷型茵株YS58中表达.重组质粒经鉴定含有sam2基因.工程菌YS58-2表达产物经SDS-PAGE,结果显示重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的分子质量约为43ku,经凝胶电泳扫描,表达带约占菌体总蛋白的14%.YS58-2菌株培养72 h的SAM合成酶活力为16.5 U/mg茵体蛋白,较出发菌S.cerevisiae TCCC 31012提高了40.3倍,较受体菌YS58提高了32倍.     

离子色谱法测定1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸中1,4-丁二磺酸的含量

建立测定1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸中1,4-丁二磺酸含量的离子色谱方法.采用Ion PacAS14(250 mm×4 mm)色谱柱,以3.5 mmol/L Na2CO3和1.0 mmol/L Na HCO3为流动相,流速为2.0 m L/min,结果表明,1,4-丁二磺酸在5.115~204.6 mg/L(r=0.999 7)范围内有良好的线性响应关系,平均回收率为99.4%,RSD为0.8%,最低检出限为1.0 ng.本法可准确测定1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸中1,4-丁二磺酸的含量,有效控制其质量.     

番茄八氢番茄红素合成酶基因的克隆及超量表达载体构建

八氢番茄红素合成酶是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄该酶的编码基因序列设计一对引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1500 bp的全长cDNA片段.测序结果表明,此片段包含一个长为1239 bp的完整的编码框,其氨基酸序列与辣椒、向日葵、万寿菊、枸杞、番木瓜、温州蜜柑、拟南芥八氢番茄红素合成酶基因编码的氨基酸序列的一致率分别为88%、75%、75%、74%、73%、73%、7l%.对这个全长片段构建了超量表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体.     

谷胱甘肽合成酶系基因协调表达体系的构建

通过 PCR获得 E.coli B谷胱甘肽合成酶系基因 ( gsh I,gsh II)片段 ,结合定点突变稀有起始密码子 ,设定 gsh I与 gsh II位置与距离 ,构建双顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I- gsh II,建立GSHI、GSH- II蛋白表达体系。结果表明 :以 0 .0 8mmol/L IPTG于 2 8℃诱导工程菌 E.coli BL2 1( DE3) ( p Trc99A/gsh I- gsh II) ,GSH- I、GSH- II蛋白比为 4.5∶ 1 ( m∶ m)时谷胱甘肽合成能力最高 ,达到每克湿菌体 8.5 mg。通过构建单顺反子重组表达载体 p Trc99A/gsh I、p Trc99A/gsh II测定GSH- I与 GSH- II蛋白的最适配比 ,结果表明 :在 GSH- I、GSH- II蛋白总量恒定的情况下 ,要提高谷胱甘肽产率 ,两者比例以 3∶ 1～ 6∶ 1为宜     

一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

以E.coli AB90054基因组中DNA为模板,采用PCR方法扩增得到glyA基因,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,并对筛选所得高表达基因工程菌G16进行培养条件和表达条件的优化。结果表明,当培养条件为38℃、pH为7.0、转速为150r/min时,基因工程菌的生长速度和菌液浓度最佳;当表达条件的诱导温度为30℃、诱导剂浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5h时,基因工程菌诱导目的蛋白表达效果最好。通过SDS-PAGE分析和酶活测定后发现,在优化条件下基因工程菌G16发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占菌体总蛋白的60%左右,且蛋白活性正常。     

一株高产果胶酶青霉菌株的筛选鉴定

从淤泥中筛选、分离纯化,得到了一株高产果胶酶的青霉菌株,编号为L5.根据培养特征、形态特征和内转录间隔区(ITS)序列分析,将L5菌株鉴定为草酸青霉菌(Penicillium oxalicum).该菌株在28℃,pH 6.0,摇床转速160 r/min条件下培养70 h,其果胶酶活性可达39 940 U.mL-1.min-1.     

禽传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株H52反向遗传株的构建

IBV H52基因组全长27.6kb,分13个1.3-2.9kb的片段扩增H52全长cDNA,额外扩增N-3’片段,并克隆到载体PMD19-T上.利用No see’m技术在每个片段中引入BsaI或BsmBI酶切位点,D1片段中引入无义突变位点,在5‘UTR端和N-3’引入T7启动子,3’UTR端引入Poly（A）尾.将克隆好的13个片段酶切,纯化,体外无缝连接为全长cDNA.将全长cDNA及N-3’体外转录获得它们的转录体,将转录体共转染BHK-21细胞,48h后收获细胞液,将细胞液接种10日龄SPF鸡胚获得反向遗传株H52-R.在鸡胚中盲传5代后,通过RT-PCR对无义突变位点进行扩增及序列分析,在反向株H52-R中发现引入的无义突变位点.对反向株H52-R的一些生物学特性如HA、EID50等测定发现,H52-R的这些生物学特性与亲本株H52相似.     

耐As（Ⅲ）及高效氧化As（Ⅲ）基因工程菌的构建

As(Ⅲ)氧化酶能够催化氧化As(Ⅲ),将水体中的As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)后,毒性将大大降低且易脱除.通过聚合酶链反应(PCR)从能高效氧化As(Ⅲ)的嗜热栖热茵株(Thermus thermophilus HB8)质粒pTF27扩增了三价砷氧化酶基因(TTHB127,TTHB128),将TTHB127、TTHB128分别定向克隆到pBBR1MCS-5载体上,构建重组质粒127pBBR128,通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,将质粒127pBBR128转移到耐性菌AS-01中,得到的工程菌127pBBR128-AS具有As(Ⅲ)的耐受性和高氧化性的功能,且127pBBR128-AS的As(Ⅲ)氧化酶活力是出发菌株AS-01的8倍.     

一株谷氨酰胺合成酶高产菌株的酶学分析及其基因的克隆分析

对谷氨酰胺合成酶菌球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)突变菌株Y3进行分析.其谷氨酰胺合成酶摇瓶发酵单位是原始菌株的2.81倍;最适反应温度为40℃;最适pH为6.5.以突变菌株和原始菌株基因组为模板,通过同源克隆策略,成功地获得了球形节杆菌谷氨酰胺合成酶基因gln片段.通过序列比对,突变菌株gln基因在第409 bp处产生T→C的碱基的突变,该处突变使酪氨酸(Tyr409)被组氨酸(His409)取代,该突变解决了谷氨酰胺合成酶腺苷酰基化问题,保证了其在高浓度铵盐条件下保持酶活性.     

玉米酒糟为主要氮源的Nisin生产菌株的诱变选育

为使乳酸乳球菌适应玉米酒糟作为发酵生产乳酸链球菌素(Nisin)的主要氮源,首先对培养基进行了初步优化,发现在酒糟清液中加入蔗糖、酵母膏和磷酸氢二钾明显促进了乳酸乳球菌的生长.在此基础上,使用等离子体对乳酸乳球菌进行诱变处理,利用24方孔深孔板技术可实现对高产Nisin突变菌株的选择性筛选.结果表明,诱变菌株在只有5.0%存活率时,得到的正突变菌株可达26.2%.借助摇瓶发酵实验对其生产Nisin的发酵水平进行研究,发现有1株诱变选育菌株发酵Nisin的活性高达6 520 U/mL,并且其发酵能力比诱变起始菌株能力更强.     

BMSCs与PLGA支架构建组织工程化骨软骨复合组织

目的:探讨同种异体骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养后种植到孔径和孔隙率不同且复合不同胶原和生长因子的PLGA支架上再种植到大鼠肌袋内构建组织工程化骨软骨复合组织的可行性。方法:制作复合BMP-2和Ι型胶原PLGA支架与复合bFGF、TGF-β1和Ⅱ型胶原PLGA支架后把两者用生物蛋白胶粘合形成复合支架,把体外培养扩增的BMSCs种植到复合支架上,植入实验组A组、对照组B组、空白组C组SD大鼠肌袋内,于术后4、8、12周取材,分别行大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化、ALP染色、扫描电镜、透视电镜观察。结果:实验组大体标本成骨区呈白色类骨样组织,质硬,成软骨区呈乳白色类软骨样组织,质较硬,两区融合;扫描电镜观察可见成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞,透视电镜尚可见细胞浆内有大量的线粒体和内质网,并见大量胶原分泌,与对照组、空白组有明显区别,组织学评分表明A组较B、C两组差异具有统计学意义(P0.05)。结论:BMSCs体外分离扩增后种植到孔径和孔隙率不同且复合不同胶原和生长因子的PLGA支架上再植入动物肌袋可构建骨软骨复合组织。     

高产5-氨基乙酰丙酸光合细菌株的分离鉴定

从不同生态环境中分离培养出20株光合细菌,进行5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的产量检测,筛选出一株分离自广州市云溪公园池塘底泥的菌株R5,其5-ALA产量最高,达4.92 mg/L.为了确定菌株R5的分类学地位,对该菌株的形态学、碳源利用情况等生理生化特性进行了研究,表明该菌株符合红假单胞菌属的生物学特征;以菌株R5基因组DNA为模板PCR扩增16S rDNA基因,对PCR产物进行了序列测定,将所测得的核酸序列与相关细菌的16S rRNA序列进行比对,并构建进化树进行系统发育分析,发现菌株R5与沼泽红假单胞菌株KUGB306(Rhodop-seudom onas palustrisKUGB306)形成一个类群,序列同源性为99%.故最后确定该高产5-ALA的菌株属于红假单胞菌属(Rhodopseudom onas).     

可控性自裂解乳球菌的构建

为阐明发酵乳杆菌温和噬菌体φPYB5编码的由穿孔素(Hyb5)和裂解素(Lyb5)组成的裂解盒在乳酸菌中的作用特征,将hyb5-lyb5基因克隆到E. coli/L. lactis穿梭质粒pSEC的nisin诱导型启动子下游,构建了重组质粒pSEC-hyb5-lyb5。将pSEC-hyb5-lyb5电转入Lactococcus lactis NZ9000,获得重组菌株NZphl。经nisin诱导表达后,Hyb5-Lyb5表现出高的裂解活性,使NZphl菌液的浊度（OD600）急剧下降,并释放出大量胞内蛋白,为利用自裂解菌株生产优质乳制品奠定了基础。     

沼泽红假单胞菌高产辅酶Q10菌株的诱变选育研究

以沼泽红假单胞菌为出发菌株,通过紫外诱变和罗红霉素抗性筛选,以期获得辅酶Q10高产菌株.试验结果表明,紫外照射时间60-70s时可能达到最大正向突变概率.通过紫外诱变、罗红霉素初筛和发酵复筛,获得一株沼泽红假单胞菌突变株R-1,辅酶Q10产量达到0.021g/L,较出发菌株产量（0.018g/L）提高16％.经过6次传代培养,突变菌株产辅酶Q10产量稳定,可用于进一步研究.