抗昆虫蝎毒素多肽的重组表达研究

蝎毒素是蝎子自我防御和捕食的有力工具,属于活性短肽。抗昆虫蝎毒素多肽作用于昆虫细胞膜离子通道,调控通道动力学特性,是潜在的生物杀虫剂,具很高的研究价值。序列比对分析发现,抗昆虫蝎毒素多肽有高保守性,序列同源性达67%,其中有4个保守的半胱氨酸残基,这可能与其抗昆虫作用的结构有关。但天然蝎毒素蛋白获取较困难,致使抗昆虫毒素多肽的结构与功能研究受限,因此,利用基因重组技术获得高纯度高活性重组蝎毒素是有效途径之一。本文综述了抗昆虫蝎毒素多肽外源重组表达的研究现状,旨在更深入全面理解其结构及抗昆虫机理等,以助推后续相关研究。     

抗痛蝎毒素多肽的重组表达研究

蝎毒素多肽作用于众多细胞膜离子通道,调控通道动力学特性。显具抗痛活性的蝎毒素多肽呈现较高的学术研究价值和医药应用前景。序列比对分析发现,抗痛蝎毒素多肽具较高保守型,序列同源性达45%,均具8个半胱氨酸残基,且其位置相对保守,这可能与抗痛功能有关。天然蝎毒素蛋白的获得、结构与功能研究受限,而高纯度、高活性重组毒素多肽是一条有效解决途径。本文综述抗痛蝎毒素多肽的重组表达,藉此推进其结构与功能相关性的理解。     

放线菌次级代谢产物合成基因簇异源表达体系的研究进展

基因簇的异源表达在放线菌次级代谢产物的发现、产量优化、生物合成途径的解析以及非天然代谢产物合成途径的构建中得到了广泛的应用,成为主要策略之一。近年来,随着高通量测序技术以及基因编辑技术的快速发展,大量的新颖次级代谢产物合成基因簇被发现,异源表达在研究放线菌次级代谢产物中起到越来越关键的作用。基于此,回顾了异源表达技术在次级代谢产物研究中的关键作用,并对其潜在的应用前景进行了展望,旨在为基因簇异源表达技术更为广泛的应用提供参考。     

大肠杆菌-链霉菌-假单胞菌穿梭表达BAC载体的构建

异源表达生理活性物质的生物合成基因簇是药物研发领域的一个重要的方向,它可通过异源表达来研究基因功能,获得目标化合物或对现有的化合物进行结构改造.生物合成基因簇一般较大,常规的DNA载体由于容量不足、拷贝数较低或不能在不同的异源宿主间穿梭表达而难以对其进行操作.本研究运用重组工程策略和常规的克隆手段,将多个异源表达所必须的功能基因克隆至常用的构建BAC文库的载体pECBAC1,获得了一个可在大肠杆菌-链霉菌一假单胞菌3个常见的异源表达宿主间进行穿梭表达的BAC载体.     

植物养分转运蛋白的分离与克隆

本文着重讨论利用异源表达分离植物养分转运蛋白基因的策略和方法，以及利用分子生物学技术与DNA重组技术研究转运蛋白分离的三种路线.     

利用转基因毕赤酵母高表达小分子药用多肽的研究

天然小肽Gsp有明显的降血糖功效,由59个氨基酸残基组成.其编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9-Gsp. 经电穿孔将该质粒转化为毕赤酵母GS115(His4- mut+),挑选His+ muts型菌株进行重组蛋白胞外表达研究.表达蛋白经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析确定了相对分子质量的正确性,其氨基酸测序显示与天然多肽序列一致,并经紫外扫描分析确定了表达量为344mg/L左右.     

东亚钳蝎抗神经兴奋肽在大肠杆菌中的表达

自从 1 96 4年以来Ｍｉｒａｎｄａ等人[1] 报道Ａｎｄｒｏｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ和Ｂｕｔｈｕｓｏｃｃｉｔａｎｕ中的神经毒素 ,蝎毒中一些神经毒素尤其是哺乳动物毒素和昆虫毒素已被广泛研究 .从新鲜蝎毒中制备和纯化天然神经毒素困难重重 ,1 988年Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ等人[2 ] 首次由Ｂｕｔｈｕｓｅｕｐｅｕｓ蝎中昆虫神经毒素氨基酸序列推导并化学合成其基因序列 ,且在杆状病毒载体中得到表达 ,自此人们广泛试验将各种属的系列蝎毒素基因重组到大肠杆菌、酵母、杆状病毒、植物等表达载体进行表达 .在中国 ,蝎子及其组织或抽提物被…     

少棘蜈蚣钠通道毒素NTX-Ssm97的表达、纯化和鉴定

以同源序列比对法从湖北少棘蜈蚣毒腺转录组数据库中筛选到了一个新的毒素多肽基因NTX-Ssm97,其序列与Nav1.7抑制性多肽μ-SLPTX-Ssm6a高度同源.采用基因工程技术,构建了pGEX-4T-1-NTX-Ssm97原核表达载体,并利用E.coli Rosetta对毒素成熟肽的原核诱导表达和分离纯化.MALDI-TOF-MS质谱鉴定结果显示:纯化的NTX-Ssm97分子量与理论值基本吻合,表明少棘蜈蚣转录组数据库有助于筛选靶向Nav1.7钠通道的抑制性毒素多肽基因.     

小麦花粉无性系变异与配子类型的表达和重组

发现了小麦花粉无性系变异具有普遍性的现象,揭示了其产生途径、类型和机制,为创造异源易位系和异源基因定位开辟了新途径．此外,论证了花粉植株的多样性是因为各种配子类型能在植株水平上充分表达,以及小麦D组染色体与黑麦R组染色体之间的重组关系．为研究植物性状的遗传与变异和单倍体育种中快速转移外源基因和高效选择提供了理论根据．     

定向射向癌细胞的“子弹”—绿脓秆菌外毒素A

绿脓杆菌能分泌多种具有剧毒的毒素,它既能致病也可杀灭使人致病的细胞。利用绿脓杆菌分泌出来的毒素去杀死肿瘤细胞是当今肿瘤治疗的研究热点之一。本期朱海兵等撰写的“F3重组毒素的克隆表达与纯化”,就是有关利用绿脓杆菌毒素构建杀死肿瘤细胞靶向治疗系统的一篇学术报告。在一个杀死肿瘤细胞的靶向治疗系统中,     

毕赤酵母表达系统的实际应用研究

在DNA体外重组和异源表达技术中,酵母表达系统是重要的一个组成部分。对于它的优势,大量中外文献用实例证明,用综述总结。酵母菌是最简单的真核模式生物,兼有原核、真核两种表达系     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

NF-κB相互作用多肽原核表达载体的构建、表达与纯化

为了获得高纯度的可溶性NF-κB相互作用多肽,首先以酵母双杂交技术筛选获得的NF-κB相互作用多肽的酵母表达质粒pGAD GH/pp10为模板,扩增多肽基因片段,后经BglⅡ,StuⅠ双酶切后连接到pET-42a(+)载体中,构建GST/多肽融合蛋白的原核表达载体,并将GST/多肽融合蛋白的原核表达载体转化入BL-21菌株,用0.4 mmol/L IPTG于30 ℃诱导表达4 h,后经GST亲和纯化GST/多肽融合蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的表达和纯度.实验结果表明,成功地构建了NF-κB相互作用多肽的GST/多肽融合蛋白原核表达载体,进行了GST/多肽融合蛋白的诱导表达,融合蛋白的表达为可溶性表达,最终纯化获得纯度约为80%的可溶性GST/多肽融合蛋白,这将为后继利用GST pull-down,Bio-sensor,EMSA等实验进一步验证NF-κB相互作用多肽的功能提供可靠的材料来源奠定基础.     

La多肽的基因克隆和表达

以人脾ｃＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ获得Ｌａ多肽（全长）的ＤＮＡ片段。将此片段利用双酶定向克隆到ＭＢＰ（麦芽糖结合蛋白）融合系统的载体ｐＭＡＬＴＭ－ｃ中得以表达。经免疫印迹实验证明，表达后的产物具有Ｌａ多肽的特异性，敏感性则超过生化制备的ＥＮＡ制品。     

血小板反应素-1活性片段的克隆与表达

选择两段血小板反应素（TSP-1）中抑制血管再生的活性片段，设计两对引物，使用RT-PCR的方法从人血细胞中进行克隆并对获得片段进行测序验证．克隆片段大小分别为723和522bp，命名为聪P-1-1和聪P-1-2．利用原核表达载体pET-29a获得大肠杆菌重组子，重组子经过IPTG诱导以包涵体的形式表达相应的多肽片段．再对包涵体进行体外溶解、纯化，得到了目的多肽．     

幽门螺杆菌重组VacA蛋白的表达、纯化和鉴定

建立从幽门螺杆菌空泡毒素A(VacA)原核表达系统pET32a-vacA-E.coliBL21DE3中,表达、纯化和鉴定重组空泡毒素A(rVacA)蛋白的方法.采用不同浓度的IPTG(0.1、0.5和1.0 mmol.L-1)诱导原核表达系统表达rVacA,10%SDS-PAGE检测表达产量,Ni-NTA亲和层析法纯化rVacA,采用HPLC检测其纯度,Western-blotting进行免疫学鉴定.从已构建的VacA原核表达系统中成功表达和纯化了rVacA蛋白,产量约占细菌总蛋白的28.4%,纯度为82.3%.为后续进一步研究该蛋白的生物活性和相关检测试剂盒奠定基础.     

鱼腥藻PCC7120染色体基因对asr0757/alr0758的表达优化及其鉴定

NCBI预测鱼腥藻PCC7120染色体上的基因对asr0757/alr0758可能构成一个毒素-抗毒素系统.为研究其是否属于毒素-抗毒素系统家族,分别构建这两个基因的表达载体.用1.0 mM IPTG诱导重组菌表达,优化表达条件,并对表达出的蛋白进行纯化与western blot检测.SDS-PAGE结果显示：asr0757与alr0758在37℃下诱导6 h后,均成功诱导表达出目的蛋白asr0757(13.5 KD)和alr0758(17.9 KD).抗毒素表达量较好,毒素alr0758表达量较少.通过设置诱导时间梯度和IPTG浓度梯度优化毒素基因表达条件,优化结果显示：毒素基因alr0758在28℃,IPTG浓度为0.4 mM,诱导10 h时有最大表达量.蛋白纯化与western blot结果证实诱导表达的蛋白为目的蛋白.     

毒性小分子蜂毒肽基因的克隆修饰、融合载体构建及表达研究

通过定点诱变的方法,对小分子蜂毒肽（melitin）基因进行修饰,引入了羟胺裂解位点,使蜂毒肽与其前体蛋白得以在体外融合表达．将融合的蜂毒肽前体蛋白（prcmelittin）经双酶切后克隆到原核表达载体PET-42a（＋）中,PCR鉴定后转化至宿主菌BL21（DE3）中,在异丙祭硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,在大肠杆菌中实现融合表达．为利用基因下程的方法表达毒性小分子多肽、实现该类药物的产业化打下基础．     

芋螺毒素lt1c的重组表达及镇痛功能

lt1c是从信号芋螺毒管中发现的一种A超家族毒素多肽,为深入研究其功能,采用pTRX表达系统将lt1c与硫氧还蛋白基因进行融合,转入大肠杆菌进行表达后,通过超声破碎、亲和层析、酶切和凝胶过滤层析等方法,最终得到目的蛋白。组织水平的青蛙坐骨神经-腓肠肌活性研究表明,重组表达的lt1c在6μmol/L浓度下,30 min内完全抑制肌肉的收缩,且其作用可逆。进一步的功能研究发现,lt1c能够抑制热板疼痛模型小鼠的舔足反应,提示A超家族芋螺毒素lt1c可能具有一定的镇痛活性。该研究为筛选新的多肽镇痛药物奠定了基础。     

CYP725A4分子序列分析与结构建模

CYP725A4在大肠杆菌等原核宿主中难以实现高效功能表达,是制约紫杉醇异源合成的瓶颈之一.文中利用生物信息学方法对该酶分子的序列进行疏水性和跨膜区分析,构建了其分子进化树,在此基础上用同源建模方法构建了其天然态以及切除N端跨膜区后的三级结构,并对CYP725A4实现功能表达所必需的辅助还原酶也进行了天然态和切除N端跨...