ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷贝整合表达载体的构建

利用PCR技术,以酿酒酵母S288c的基因组DNA为模板,扩增酿酒酵母肌醇-1-磷酸合成酶基因(ScINO1)包含1 602bp的开放读码框,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定,测序结果与GenBank上已登录的ScINO1序列完全一致.对PUG6载体进行改造,构建了rDNA介导的多拷贝整合表达载体pURH,并将ScINO1基因连入载体pURH,获得ScINO1基因超表达载体pURIH.为下一步的微生物发酵法产肌醇和获得能够耐高乙醇的酵母工程菌株的研究奠定基础.     

lys1-d缺陷型标记介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合

传统构建毕赤酵母质粒多拷贝菌株的方法不仅操作复杂、成本高,而且难以获得理想中的高拷贝菌株.近来,一种利用leu2-d缺陷型标记直接筛选毕赤酵母多拷贝克隆的方法显示出很大的便利.本研究发现,使用一个lys1-d缺陷型标记能更加高效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合.首先构建一个携带lys1-d和EGFP(enhanced green fluorescent protein)报告基因的整合载体,然后将载体转化至敲除了内源lys1基因的毕赤酵母中,最后分别检测了转化子内EGFP含量和质粒拷贝数.结果显示,所有转化子整合的质粒拷贝数均处于19～168之间;并且转化子内质粒拷贝数越高,其胞内表达的EGFP产量也越高.这一系统为构建毕赤酵母超高拷贝质粒整合菌株增添了有效的工具.     

天蚕抗菌肽B基因在毕赤酵母中多拷贝表达载体的构建

根据Bgl Ⅱ和BamHⅠ同尾酶的特点,通过对pPIC9K／CB进行改造,获得了不含BamHⅠ位点的CecropinB表达框,并在此基础上构建了含三拷贝CecropinB表达框的毕赤酵母表达载体,为CecropinB的进一步开发与应用打下了基础。     

rDNA介导的菊粉酶基因整合载体构建及在K.marxianus中应用

为提高Kluyveromyces marxianus(K.marxianus)发酵菊芋粉生产乙醇过程中的菊粉酶活性,以酿酒酵母rDNA为整合位点,构建菊粉酶基因的整合表达载体pFA6a-rDNA-pgk-inu.经Sph I线性化后,采用电击法转化K.marxianus,使表达载体整合到K.marxianus的染色体上.经PCR鉴定的阳性转化子能够分泌菊粉酶且能在无筛选压力下稳定遗传50代.重组菌K/r-2分泌的菊粉酶活力为140U/mL,比出发菌株提高了80%.以粗菊芋粉生料为底物进行了补料发酵,重组菌株的发酵终点乙醇浓度为76.5g/L,比出发菌株提高了5g/L,达到理论转化率的96%.这些研究工作为非粮作物菊芋生产燃料乙醇奠定了基础.     

短小芽孢杆菌C-9葡聚糖内切酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)C-9中克隆得到葡聚糖内切酶基因,该基因包含1980 bp核苷酸,编码559个氨基酸,其N端有一个预测的29个氨基酸的信号肽序列;以YIp5质粒为骨架,构建rDNA介导的多拷贝整合载体,实现葡聚糖内切酶在酿酒酵母中的高效、稳定表达。与对照菌株相比,含有葡聚糖内切酶基因的重组酿酒酵母可以在以羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基上生长。     

突变野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的整合表达

用定向进化的一种新方法,对野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)的α-淀粉酶基因(XAMY)进行PCR体外诱变后获得了一个编码的酶活性提高的突变基因,将其克隆到由rDNA序列介导的酵母整合型表达载体pHBM368上,得到重组质粒pHBM368XA.将pHBM368XA转化酿酒酵母S.cerevisiae INVScⅠ,获得了整合型分泌表达α-淀粉酶的酵母重组菌株XA01.对选择的3个工程菌α-淀粉酶表达的稳定性进行了检测,结果表明在完全培养基中连续培养80代,淀粉酶的酶活性仍然保持稳定.在淀粉酶自身信号肽引导下,胞外分泌效率可达50%.     

结合利用pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的多拷贝载体并在毕赤酵母中表达

结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的可线性化多拷贝表达载体,并转化毕赤酵母表达目的蛋白.首先将目的蛋白基因构建到组成型表达载体pGAPZαA中,然后依据载体自身特性,用同尾酶BglⅡ和Bam HⅠ切取其表达盒并连接到甲醇诱导型载体pPICZαA中的Bam HⅠ位点处,经多次重复后获得目的蛋白多拷贝表达载体,线性化后电转化毕赤酵母表达目的蛋白.灵芝免疫调节蛋白LZ8是一个已成功在毕赤酵母中表达的蛋白,作为检验该方法的样本其基因被首先构建到载体pGAPZαA中得到质粒pGAPZαA-LZ8,切取其表达盒构建到载体pPICZαA中,经过4次重复得到了多拷贝表达载体pPICZαA-[GAPZαA-LZ8]4,然后利用pPICZαA特有的限制性内切酶位点SacⅠ进行线性化,最终电转化到毕赤酵母GS115中进行组成型表达蛋白LZ8,其表达量达到pGAPZαA-LZ8转化菌株表达量的2~3倍.经检验,结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA可以构建目的蛋白的多拷贝表达载体,并且可以对载体进行线性化而不影响转化酵母时的转化效率.     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

绿色木霉EG III基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

 通过RT PCR从绿色木霉AS33711中克隆得到EG III基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉 eg3 的同源性为99.6%。将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2489,通过SDS PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析。结果表明：转化子有明显的重组EG III表达带,能够产生CMC水解圈,说明 eg3 基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG III的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG III的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉 eg3 基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达。     

真核生物多顺反子表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

利用DNA重组技术将抗肿瘤血管生成的内皮抑素基因endostatin插入含有FHIT(抗肿瘤人脆性组氨酸三联体基因)和EGFP的pIRES2-FHIT-EGFP载体中构建了真核多顺反子表达载体pES-IRES-FHIT-IRES-EGFP,用脂质体法转染Hela细胞后,用G418筛选出稳定转染的细胞.经RT-PCR、RT-PCR southern blot、northern blot和免疫细胞化学分析,结果证明单顺反子和三顺反子在RNA水平都得到表达.在蛋白表达水平上,荧光观察和免疫细胞化学分析结果显示Endostatin、FHIT和EGFP在Hela细胞中均得到表达,为基因药物和肿瘤多基因治疗奠定了基础.     

Unequal crossing over in the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae

Unequal sister chromatid exchanges occur at the ribosomal DNA locus of yeast during mitotic growth. The frequency of unequal crossing over, as measured by the deletion or duplication of an inserted genetic marker (LEU2), is sufficient to maintain the sequence homogeneity of the rDNA repeat units.     

Construction of recombinant industrial Saccharomyces cerevisiae strain with bglS gene insertion into PEP4 locus by homologous recombination

The bglS gene encoding endo-1,3-1,4-β-glucanase from Bacillus subtil＆ was cloned and sequenced in this study. The bglS expression cassette, including PGK1 promoter, bglS gene fused to the signal sequence of the yeast mating pheromone a-factor （MFals）, and ADH1 terminator with G418-resistance as the selected marker, was constructed. Then one of the PEP4 allele of Saccharomyces cerevisiae WZ65 strain was replaced by bglS expression cassette using chromosomal integration of polymerase chain reaction （PCR）-mediated homologous recombination, and the bglS gene was expressed simultaneously. The recombinant strain S. cerevisiae （SC-βG） was preliminarily screened by the clearing hydrolysis zone formed after the barley β-glucan was hydrolyzed in the plate and no proteinase A （PrA） activity was measured in fermenting liquor. The results of PCR analysis of genome DNA showed that one of the PEP4 allele had been replaced and bglS gene had been inserted into the locus of PEP4 gene in recombinant strains. Different endo-1,3-1,4-β-glucanase assay methods showed that the recombinant strain SC-βG had high endo-1,3-1,4-β-glucanase expression level with the maximum of 69.3 U/（h·ml） after 60 h of incubation. Meanwhile, the Congo Red method was suitable for the determination of endo-1,3-1,4-β-glucanase activity during the actual brewing process. The current research implies that the constructed yeast strain could be utilized to improve the industrial brewing property of beer.     

企业门户中的信息与应用整合方法

组织对信息进行管理的要求越来越强烈,企业门户的出现能够满足这种需求,解决组织中信息管理的难题.企业门户的作用就是整合组织各种信息和应用,同时实现对组织知识的创造、获取、传递和应用.文章从企业门户的基本功能出发,集中论述了企业门户如何有效整合组织内部的各类数据和应用系统,以达到支持决策和协作目的的问题.     

信息集成在监管系统中的应用

随着信息技术的普及,不少监管部门也在实施信息工程的改造,但如何将各孤立的应用集成到同一平台下,为监管人员提供更高效快捷准确的服务,是普遍的问题。以某看守所安全防范系统的设计开发为例,简要的介绍了如何在该系统中利用数据集成和应用集成,实现监管系统中的联动处理。     

DNA分子标记在水稻遗传育种上的应用

综述了近年来DNA分子标记在水稻遗传图谱的构建,基因标记,辅助选择育种等方面研究的应用.     

数据中心在学校信息整合中的应用研究

在分析了学校目前的IT架构和各业务系统的应用现状和所面临的困难的基础上,提出了信息整合的分层整合架构,就数据整合层所涉及的数据中心设计及实现进行了详细论述。     

一种DNA荧光测定体系的研究与应用

应用钙黄绿素-藏红T为荧光探针,建立了新的DNA测定方法.研究了钙黄绿素-藏红T荧光能量转移体系的荧光性能及其与DNA的结合反应.当pH=8.00时,hsDNA、smDNA和ctDNA的含量与钙黄绿素-藏红T的荧光比值变化量Δ(Fd Fa)具有良好的线性关系,线性范围分别为0.10-5.00、0.50-4.00、0 30-5.00μg mL,检测限(3σ K)分别为0.016、0.021和0.020μg mL;测定DNA合成样品,回收率为91 3%-103.3%.     

中国棉铃虫核多角体病毒(Heliothis armigera NPV)VHA273毒株DNA的酶切分析与比较研究

VHA273毒株原为MNPV型,经纯系中国棉铃虫扩增而得出约10％的SNPV.高度纯化两型多用体,温和碱解后,酚法抽提SNPVDNA和MNPVDNA.限制性内切酶BglⅡ,BamHI,EcoRI和HindⅢ分别平行酶切两种DNA,依次均得出11,8,14和13条电泳带．比较分析DNA的酶切电泳图谱发现,经同一种限制性内切酶酶切,SNPVDNA与MNPVDNA不仅电泳片段数相同,电泳带位也-一对应．讨论提出：该SNPVDNA与MNPVDNA在分子、亚分子水平上是一致的．